C%2fEBP-α基因诱导肝细胞和肝星状细胞凋亡差异的体内外的研究及其乙酰化调控探讨.pdf

C／EBP．伍基因诱导肝细胞和肝星状细胞凋亡差异的体内外 研究及乙酰化调控探讨 中文摘要 ．-1_‘●--J-● 日lJ舌 肝纤维化及其终末期疾病肝硬化目前仍是困扰全球的健康问题。它可以由 多种疾病引起，最终可导致肝功能衰竭和门静脉高压，目前尚无有效治疗方法， 终末期多需要肝脏移植。因此，了解其发病机制对其预防和治疗十分重要。 stellate cells，HSCs)的激活为肝纤维化发生 目前认为肝星状细胞(hepatic 发展的中心环节。静止状态下HSCs为一种储存维生素A和脂类的非实质细胞，可 以维持正常情况下肝脏的基底膜基质平衡。肝脏损伤可以诱导HSCs激活，使其 失去储存脂类的特征，增生并合成富含I型胶原纤维的纤维基质。激活的HSCs还 可以释放炎症因子和多种致纤维化的细胞因子，以及组织金属蛋白酶抑制剂 (tissueinhibitors 原纤维沉积，最终导致肝纤维化。 长久以来一直认为肝纤维化是不可逆转的，但是近年来研究发现，肝纤维化 是可以逆转的，其中心环节是激活的HSCs发生凋亡。因此，如何促使激活的HSCs 发生凋亡成为防治肝纤维化的重要目标。 目前认为HSCs的分化类似于脂肪细胞。因而一些特异性调控脂肪细胞分化 的基因也可能调控HSCs的分化。CCAAT增强子结合蛋白(CCAATenhancer binding 调控前脂肪细胞的成熟和分化。我们课题组的前期研究发现C／EBP—c【可以在体 内和体外诱导HSCs发生凋亡。但是C／EBP．13,对肝细胞有何作用，以及其对肝 细胞和HSCs的作用有无差异仍知之甚少。因此，我们采用表达C／EBP．0【的腺 的差异。此外，我们进一步研究了HSCs中C／EBP．0【是否受乙酰化调控，旨在 了解乙酰化调控机制在C／EBP．c【诱导HSCs凋亡中的作用，以期进一步了解肝 纤维化的发病机制。 第一部分腺病毒介导的C／EBP．n基因诱导肝细胞和I-ISCs凋亡差异的体外研 究 目的检测腺病毒介导的C／EBP一0【基因诱导肝细胞和HSCs凋亡有无差异。 用DNAladder电泳、流式细胞仪、AnnexinV／PI染色检测两种细胞凋亡有无差 异，以及Western 表达情况，探讨C／EBP．0【诱导两种细胞的凋亡途径有无差异。 ladder结果显示 结果HSCs和肝细胞对C／EBP—a诱导的凋亡有显著差异。DNA HSCs从50MOI开始就产生DNAladder现象，而肝细胞直到200MOI也没有发 Blot法结果 显著凋亡，并呈剂量依赖性增高。而肝细胞无明显变化。Western 8， 才会引起肝细胞发生凋亡。Caspase9参与了两种细胞的凋亡途径，而Caspase 9抑制剂可以显著 12未参与Ad．C／EBP．Q诱导的两种细胞的凋亡途径。Caspase 抑制HSCs的凋亡，但仅部分抑制肝细胞的凋亡。 结论Ad．C／EBP．0【诱导肝细胞和HSCs发生凋亡在剂量上有显著差异，但都是 与线粒体途径有关。 第二部分腺病毒介导的C／EBP。伍基因诱导肝细胞和HSCs凋亡差异的体内研 究 目的检测腺病毒介导的C／EBP．c【基因对CCl4诱导的小鼠肝纤维化的作用。 方法采用腹腔注射CCl4建立Balb／c小鼠的肝纤维化模型。从造模第1周(早 期预防组)或第6周(晚期治疗组)通过尾静脉注射Ad．C／EBP．a，10周后处 死动物。采用免疫组织化学方法和WesternBlot检测C／EBP．旺在肝脏内的表达。 透射电镜观察血窦内皮结构。眼球采血检测小鼠血清白蛋白、总蛋白、ALT、y-GT 的表达。常规HE染色和天狼猩红染色以及肝组织羟脯氨酸含量测定来检测不 同实