绢丝昆虫线粒体DNA+A%2bT丰富区序列克隆及分子进化分析.pdfVIP

Abstract 绢丝昆虫线粒体DNA A+T 丰富区序列的克隆与分子进化分析 摘 要 家蚕（Bombyx mori ）是鳞翅目的一种重要模式昆虫，对其起源和分化的研究一 直受到蚕业科学界的高度重视，并随着科学技术的进步和考古发现而不断推向深入， 取得了很大的进展。家蚕的中国起源学说已经成为学界的共识，然而对于家蚕起源的 地域性和化性分化却一直存在着争论，形成了两种不同的学说：家蚕起源黄河流域的 “一中心”学说和多地域起源的“多中心”学说。 动物线粒体DNA （Mitochondrial DNA,mtDNA ）具有分子量小、便于实验操作、 变异速度快和母性遗传等特点，被广泛用于种群遗传和物种分子进化分析。mtDNA 控制区（D-环）因富含腺嘌呤（A ）和胸腺嘧啶（T ），被称为A + T 丰富区，是动物 线粒体基因组序列和长度变异最大的区域。利用线粒体DNA 基因组中保守性的蛋白 质编码基因或rRNA 基因等序列分析家蚕和蓖麻蚕（Philosamia cynthia ricini ）等绢丝 昆虫系统发育和分子进化已有较多报道，但是鲜见用线粒体基因组A+T 丰富区分析 家蚕等绢丝昆虫的进化。 本研究选择12 个家蚕品种以及镇江野桑蚕（Bombyx mandarina Zhenjiang strain ）、 蓖麻蚕、樗蚕（Philosamia cynthia cynthia ）和柳蚕（Actias selene ningdoana ）为材料， 分别从蛹体中提取线粒体 DNA 。家蚕品种分别为：三四、大草、邯郸种、迈索尔、 大造、萨尼斯、余杭二化、沿河1 号、新昌12 号、安康4 号、甘肃种、兰5，从化性 上分包括一化性、二化性和多化性品种，从地理系统上划分包括中国系统、日本系统、 欧洲系统和热带系统，从茧色上划分包括白色、橘红色、淡橘红色、金黄色、淡黄绿 色。根据已发表的家蚕和野桑蚕mtDNA 控制区及其侧翼序列，设计1 对PCR 引物， 用PCR 方法克隆线粒体A + T 丰富区及其侧翼序列，并进行序列测定。 序列分析表明，家蚕品种克隆片段平均长度约1.1 kb，镇江野桑蚕的克隆片段为 1085 bp，蓖麻蚕、樗蚕和柳蚕该区段长度分别为951 bp、952 bp 和930 bp，它们的基 因排列顺序均与家蚕品种C108 相同，依次为 12S rRNA 基因3′ 端、A+T 丰富区、 tRNA-Met 、tRNA-Ile 、tRNA-Gln 和ND2 基因5′ 端，在tRNA-Gln 和ND2 基因之间 有一段非编码区。家蚕品种的克隆片段及C108 和青熟（Aojuku ）间核苷酸序列的同 Abstract 源性均在99% 以上，其中C108、兰5 和青熟三者完全一致；沿河1 号和大造与C108 相比，只在控制区的T- 串（Thymine-stretch ）和A- 串（Adenine-stretch ）长度上有1-2 个碱基的差异；在14 个品种中，共检测到19 个碱基替换（15 个转换，4 个颠换）和 6 个碱基缺失，主要分布在A + T 丰富区。 为了研究家蚕品种的起源以及家蚕和大蚕蛾科绢丝昆虫的亲缘关系，我们以黑腹 果蝇（Drosophila melanogaster ）线粒体DNA 为外群，分别采用Phylip3.66 软件包的 邻位相连法（DNA NJ ）和最大可能性法（DNA ML ），构建了基于14 个家蚕品种和4 个野桑蚕品系mtDNA A + T 丰富区及其侧翼序列的进化树和基于2 个家蚕品种和柞蚕 （Antheraea pernyi ）、蓖麻蚕、樗蚕、柳蚕4 种5 个品系的大蚕蛾科绢丝昆虫mtDNA A + T 丰富区序列的进化树。在前一进化树中，14 个家蚕品种与2 个中国野桑蚕聚为 一亚群，而2 个日本野桑蚕单独聚为另一亚群，说明家蚕品种与中国野桑蚕的亲缘关 系更近、与日本野桑蚕（Japanese Bombyx mandarina ）较远；在14 个家蚕品种中，甘 肃种的进化早于其它品种，说明甘肃种是本试验研究中进化最早的家蚕品种。在后一 进化树中，柳蚕与蓖麻蚕、樗蚕三者的亲缘关系较近，与柞蚕的亲缘关系较远，与家 蚕的亲缘关系更远；在所研究的绢丝昆虫中蓖麻蚕和樗蚕的亲缘关系最近。 本研究结果在线粒体基因组水平上为家蚕起源于