幼鼠肠缺血%2f再灌注损伤中肿瘤坏死因子的实验的分析.pdf

中文摘要 + 前 言 科常见的组织器官损伤之一，不仅表现在某些肠道疾病的发展过 程中，也是创伤、感染、内脏动脉阻塞性及失血性休克等疾病共同 经历的病理生理过程。以往对肠I／R损伤机制的认识主要着重于 氧自由基损伤、能量衰竭、细胞内钙超载、白细胞粘附与内皮细胞 损伤等。近年来细胞因子在肠I／R损伤中的作用机制逐渐受到重 NecrosisFactor 视。其中肿瘤坏死因子(Tumor a简称TNF—d)是 肠I／R损伤中细胞因子链锁反应的一个关键性介质。肠I／R损伤 中TNF—a的产生及作用机制目前并不十分清楚，在幼龄动物模型 中报道更为少见。 本研究应用幼鼠肠I／R模型，观察肠I／R不同时点肠、肝组 织TNF—a的蛋白表达，门静脉血中和外周血中TNF—a水平变化， 及其与肠组织损伤的关系；同时观察肠I／R不同时点肠组织 TNF～a的来源、刺激因素、作用、变化及TNF—a表达的相关调控 因素。 ／ 实验材料 I 氯胺酮经腹腔注入，麻醉后右侧卧位，取腹膜后人路，分离肠系膜 上动脉。 分钟组(1120’G)。 3．标本采集及处理： (1)肠管、肝组织置于10％福尔马林液中固定。 (2)经殷动脉、门静脉取血离心，血清于--70℃冰箱保存。 后置于一70℃冰箱保存。 实验方法 1．检测方法：1)免疫组织化学法：肠、肝组织常规固定，石蜡 包埋，切片，用羊抗TNF—a多克隆抗体和过氧化物酶标记的链酶 卵白素(SP)染色试剂盒检测TNF—n蛋白阳性细胞存在。2)病理 组织学：肠组织切片进行苏木素一伊红染色(HE)，观察不同I／R时 点肠组织病理变化。3)放射免疫法：根据待测样品TNF一0t和1125标 记TNF-a竞争性与特异性抗体相结合原理，采用液相竞争放射免 疫法检测血清中TNF—a的浓度。4)RT—PCR半定量测定：用TRI— ZOL总RNA提取试剂提取肠组织总RNA，反转录合成cDNA PCR产物，检测肠组织TNF—a 第一链，分别扩增TNF—a、c—los mRNA、c—los mRNA表达。 2．结果判定及数据处理：1)免疫组织化学结果半定量判定： 阳性强度按显色深度和阳性颗粒的大小、数量分为阴性(一)、可疑 色后肠粘膜损伤按Chiu氏六级评分评价。3)样品血清浓度用X± s表示，组问样本均数进行t检验。4)以内参照值标准化TNF—a、 c—los值，得到TNF—a、c—los相对含量用X±S表示，样本均数作t 检验。 实验结果 ·2· 可见阳性物质。肠组织内阳性物质主要分布于粘膜层。 2．肠组织HE染色显示130’G肠粘膜轻度受损，损伤限于粘 膜中度受损，部分粘膜丧失，坏死增多；1120’G肠粘膜重度受损， 坏死、出血更为严重、广泛。 1120’G门静脉血中TNF—a水平显著高于外周血水平(Po．05)。 4．肠组织内TNF—amRNA缺血期升高(1．55士0．33)，130’／ 降；c—los 平。 讨 论 1．肠I／R损伤时TNF—a的来源：肝脏作为第一个暴露于各 种来自肠道毒素的器官，且含有大量单核巨噬细胞，所以肝脏可能 OF在猪肠I／R实验中， 成为肠I／R时TNF—Q的主要来源。Bath 提出肠I／R时TNF—d可能是由肠系膜上动脉阻塞后，部分灌流的 脏器如胰腺、十二指肠、肝脏、左半结肠产生。但在本研究中，我们 观察到肠粘膜层TNF—a表达明显高于肝组织，且不同I／R时点门 静脉血中TNF—a水平显著高于外周血水平，因此推断在我们实验 的肠I／R各时点，TNF—a可能主要来源于肠道组织。同时，在本实 ·3。 几个时段上升，提示随着肠I／R时间延长，远隔脏器损伤