升陷汤抑制肺癌A549细胞增殖和侵袭转移作用.pdfVIP

中文摘要 升陷汤抑制肺癌A549细胞增殖和 侵袭转移作用的研究 摘 要 目的：本研究旨在体外筛选出升陷汤抑制人肺癌A549细胞侵袭转移 的有效萃取部位，并对其分子机制进行探讨，为中药复方的研究提供可行 的方法。 方法： 1 药物制备：升陷汤有机溶剂萃取部位，由华北制药集团新药研发 有限责任公司制备。 2 四甲基偶氮唑蓝法(MTT法)筛选抗肿瘤活性部位：取对数生长 实验组各孔加入升陷汤不同部位萃取成分20“l，使其终浓度分别为400、 200、100、80、40、20 mg／L；阴性对照孔加入完全培养基；每组均设4 h、48h、72 个复孔，置于饱和湿度、37℃、5％C02培养箱中分别培养24 h，弃去培养上清，每孔加 h，各孔加入Mrr(5mg／m1)20m，继续培养4 入DMS01 nnl、参考波长620nlTl检测各孔光 509l，混匀后以测定波长492 密度(OD)值，计算升陷汤不同部位萃取成分对细胞增殖的抑制率。 3 Annexin V／PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率：分别以20、40 和80 h，弃培养基， mg／L的升陷汤正丁醇提取物作用于A549细胞24 1× 0．25％胰蛋白酶消化收集细胞，用冷PBS洗涤细胞两次。用400ul Binding Allnexill V-FITC，轻轻混匀后于2．8℃避光条件下孵育15分钟。加入1 O山 PI后轻轻混匀，于2．80C避光条件下孵育5分钟。在1小时内用流式细胞 仪检测。 4细胞划痕实验：取对数生长期的A549细胞，调整细胞浓度为 液器尖在每个孔内划一道痕，用PBS轻轻洗涤除掉脱落的细胞，实验组 各孔加入不同浓度的正丁醇提取物各2009l，使其终浓度分别为20、40、 中文摘要 80mg／L,阴性对照孔加入完全培养基；每组均设2个复孔，置于饱和湿 h后观察并照相． 度、37℃、5％co：培养箱中培养，24 5细胞迁移性测定：取对数生长期A549细胞，0．25％胰酶消化，用不 含胎牛血清的RPMll640培养基洗细胞3次，配制细胞悬液，调整浓度为 阴性对照孔加入完全培养基，每组设3个复孔；下室加入6009l无胎牛血 清的RPMll640培养基，37℃，5％C02培养箱中孵育24h。取出Transwell 小室，用PBS洗2遍，棉拭子擦去膜上面未迁移的细胞，4％多聚甲醛．PBS 相差显微镜观察并拍照，每个样片随机取4个视野拍照并计数，计算平均 值。每组重复5次。 6 Western 平：取对数期A549细胞，加入不同浓度正丁醇提取物或者RPMll640培 h后，用预冷的 养基，于37℃、体积分数为5％的C02培养箱中培养24 PBS洗3遍，刮下细胞，蛋白提取试剂盒提取总蛋白，加入一定量的4×上 样缓冲液，沸水浴中煮沸5min。用质量分数为20％的SDS聚丙烯酰胺凝 胶电泳分离蛋白，分离的蛋白电转移至PVDF膜后，用脱脂牛奶室温封闭 lh，一抗4。C孵育过夜，PBS．T洗膜20minx3次，加入红外线标记的二