介导no信转导的人可溶性鸟苷酸环化酶的表达纯化及其结构与性质研究.pdf

摘 要 LJ和MuradF)因发现“NO是心血 RF,Ignarro 美国的三位科学家(Furchgott 管系统中一种重要的信号转导分子”而荣获了诺贝尔生理和医学奖。至此以后， NO信号转导越发受到人们的密切关注。可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)是介导NO 信号转导通路中的一个核心金属蛋白，扮演着NO受体这一重要角色。NO结 知的一个重要的二级信使分子，通过对其效应蛋白的调节进而在多种生理过程中 起着重要的作用，例如促进血管和平滑肌舒张；抑制血小板凝聚、血管重塑、细 胞凋亡和炎症发生以及参与神经传递等等。一旦NO信号转导通路异常，将会 导致多种疾病的发生，如多种心血管疾病(如肺动脉高血压、心力衰竭、动脉粥 样硬化和再狭窄等)及神经退行性疾病等。 真核生物sGC是一个含b型血红素，由0【和D亚基组成的异源二聚体 异源二聚体形式最为广泛，研究也最多。按照同源序列和结构功能的分析，Q和 p亚基都可以大致分为三大结构域，分别是N．端血红素结构域(属于H．NOX 曲(CC)结构域)和C．端催化结构域。其中血红素结构域是sGC研究的核心， 因为它正是信号分子NO／CO等的调节结构域，信号小分子的调节机理研究对 NO信号转导异常所引发的疾病诊断治疗及新药开发具有重要的指导意义，也是 近年来化学生物学研究领域的热点。 sGC的研究己历经三十多年，目前已有近5000篇文献报道。但是许多关 键问题尚未彻底解决，一直存在争议。例如，血红素是sGC活性调节的一个重 要的辅基，但是它的结合区域及方式备受争议；NO激活及失活机理也是众说纷 纭，仍无定论；a和p亚基异源二聚关键作用部位及其作用机理也尚待解决； sGC的晶体结构更是鲜有报道。所有问题的一大源头就是能否获取足量的蛋白。 这么多年来sGC蛋白多数都是通过组织提取或者昆虫细胞表达而得，但是这些 方法蛋白的产量都不高，而且耗费高，可以满足对其活性的测定研究，但是在很 大程度上它限制了sGC的深入研究，尤其是在分子水平上详细研究其结构．性 质一反应关系。大肠杆菌一直都以高效率、低成本、高产量著称，因此能否在大 肠杆菌中成功的表达纯化我们所需的sGC蛋白是该课题研究之初最大的挑战。 本论文的核心内容是集中在对sGC血红素结构域的研究。首先我们对人 hsGC[3384和hsGCl3619)进行了质粒构建及其在大肠杆菌中的表达与纯化研究， 成功建立了一套hsGC蛋白的高效表达与纯化体系(产量约20 mg／L培养液)， 解决了sGC研究中的第一大瓶颈问题，为之后的结构．性质．反应研究奠定了很 好的基础。这一体系我们己经申请了专利。通过同源结构模拟及能量优化我们得 到了hsGCl3195蛋白的结构模型。在血红素重组基础上，我们对含血红素的 hsGC蛋白进行了紫外可见光谱、EPR谱、圆二色光谱、荧光光谱的性质研究， 研究发现血红素结构域(hsGCl3195)可以作为一个很好的工具用以进行sGC血 红素相关的性质研究。变温圆二色光谱结果表明hsGCl3195蛋白脱辅基和含血 oc，说明两种形式都具有 红素形式的转变中点温度分别是56±l。C和54±3 较好的热稳定性。pH滴定实验结果显示酸滴定和碱滴定的滴定中点(pKa)值 分别为5．7±0．2和9．3±O．1，说明hsGCl3195蛋白具有较好的碱稳定性，但是 在酸性条件下血红素容易脱出，蛋白容易沉淀。hsGCl3195蛋白中只含有一个色 氨酸(Trp22)，通过监测Trp22内源荧光光谱可以用来研究蛋白的构象变化。 素重组后荧光最大发射波长(k舣)红移，荧光信号强度大幅度下降，说明蛋白 的构象发生了较大的变化，尤其是还原态和NO结合态，荧光信号几乎完全淬 灭。我们推测是血红素结合后引发第一个(It螺旋(aA)构象变化，使得Glul0 (位于uA螺旋上)与Trp22相对位置改变并淬灭荧光。1．苯胺基萘．8．磺酸 (ANS)是一个常用的疏水荧光探针，ANS外源荧光光谱结果显示ANS可能 会与血红素部分竞争结合sGC疏水腔。 为了探讨血红素的结合区域及作用方式，我们成功构建并表达纯化了0【l亚 基血红素结构域(hsGCa259)蛋白，并首次探索了其在血红素结合、NO／