低密度脂蛋白偶联N-琥珀酰壳聚糖纳米粒共转运siRNA%2f阿霉素肿瘤靶向递药系统.pdfVIP

低密度脂蛋白偶联N-琥珀酰壳聚糖纳米粒共转运siRNA/阿霉素肿瘤靶向递药系统 中文提要 中文提要 目的 从血浆中分离低密度脂蛋白（low-density lipoprotein, LDL），与胆固醇 修饰的多药耐药（multidrug resistance, MDR ）小干扰RNA （small interference RNA, siRNA ）形成siRNA/LDL 复合物。合成中性条件下即有较好溶解度的N-琥珀酰壳 聚糖（N-succinyl chitosan, SCS ），并以之为载体，以阿霉素（doxorubicin, Dox ）为 模型药物，制备 siRNA/LDL 偶联 的阿霉素 N- 琥珀酰壳聚糖纳米粒 （Dox-siRNA/LDL-SCS-NPs ），利用LDL 的内源性优势和靶向作用，实现siRNA 和抗癌药物的有效共转运，增加抗肿瘤疗效。 方法 （1）采用溴化钾密度梯度离心法从人血浆中分离LDL，对其粒径分布 和形态进行考察，并验证LDL 的体外靶向性。（2 ）合成N-琥珀酰壳聚糖，通过红 1 外光谱、H-NMR 表征其结构。以其为载体，采用交联法制备阿霉素N-琥珀酰壳 聚糖纳米粒（Dox-SCS-NPs ），通过单因素考察和正交设计优化纳米粒的制备工艺， 再通过缩合反应制备 LDL 偶联的Dox-SCS-NPs （Dox-LDL-SCS-NPs ）。利用红外 光谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳对纳米粒进行表征，并考察其在不同介质中的释放特 性。（3 ）将胆固醇修饰的siRNA 与LDL 孵育制备siRNA/LDL 复合物，并考察该 复合物的血清稳定性和对 siRNA 的酶保护作用。制备共转运纳米粒 Dox-siRNA/LDL-SCS-NPs ，考察纳米粒的细胞毒性，通过不同抑制剂研究纳米粒 的细胞摄取机制，对纳米粒中siRNA 的转染效果和mRNA 水平逆转耐药性进行研 究。（4 ）体外溶血试验评价共转运纳米粒的安全性；考察 Dox 及其纳米粒在巨噬 细胞中的摄取以评价纳米粒逃避巨噬细胞吞噬的能力。（5 ）建立皮下瘤和肝原位 瘤模型，以Cy7 标记纳米粒，利用小动物活体成像技术考察纳米粒的体内分布。 结果 （1）分离得到的LDL 平均粒径为(23.4±0.58) nm ，形态圆整，其摄取 1 由LDL 受体介导。（2 ）合成了SCS，其结构得到红外光谱和 H-NMR 的验证。通 过单因素试验和正交设计优化法制备的 Dox-LDL-SCS-NPs 平均粒径(206.4±9.2) nm ，PDI 为0.215，包封率(71.06±1.42)%，载药量(12.35±0.87)% 。透射电镜、红外 光谱和电泳结果均表明LDL 已成功偶联至纳米粒，而不是简单的物理混合。纳米 粒中阿霉素的释放具有缓释性，且在酸性条件下释放更为迅速。（3 ）优化的 I 中文提要 低密度脂蛋白偶联N-琥珀酰壳聚糖纳米粒共转运siRNA/阿霉素肿瘤靶向递药系统 siRNA/LDL 复合摩尔比为30:1，LDL 对siRNA 的酶降解具有保护作用。与原料药 和未修饰纳米粒相比，LDL 偶联的纳米粒对HepG2 和HepG2/ADM 的细胞毒性更 强，而对正常肝细胞L-02 的毒性较弱。纳米粒可能通过网格蛋白和细胞质膜微囊 介导的内吞途径进入细胞，其中还可能有SR-B 族受体的参与。脂筏结构的完整性 对LDL 偶联纳米粒的摄取也具有显著影响。体外转染和RT-PCR 结果显示，共转 运纳米粒能有效转染进入细胞并在mRNA 水平抑制耐药基因的表达。（4 ）共转运 纳米粒的巨噬细胞摄取量低于原料药、未修饰纳米粒以及游离 siRNA，siRNA 制 备成纳米粒后可以有效地减少巨噬细胞吞噬。（5 ）小动物活体成像实验显示纳米 粒对皮下瘤和肝原位瘤具有良好的靶向性。 结论 优化的纳米粒制备工艺简单易行，方法稳定。LDL 偶联的纳米粒对肿 瘤细胞更具亲和力，能有效转染siRNA 抑制耐药基因的表达，对siRNA 逃避巨噬