A型产气荚膜梭减毒株的构建及肉毒毒素A、B重链片段嵌合表达的研究.pdf

摘要 肉毒毒素是由肉毒梭菌产生的一类神经毒素，能够在人和动物体内引发肉毒中毒，抑制神经 传递素的释放，造成机体瘫痪，致死率极高，属于典型的生物战剂，一直以来在国际范围内普遍 受到各国关注。在其所有致病方式中，食源性的肉毒中毒是临床上最常见的。尽管，在对BoNT 的检测和控制方面已经取得了一些成绩，但是，始终没有研发出免疫效果令人满意的肉毒疫苗。 近年来，关于活细菌口服疫苗的已经报道越来越多，其优势日趋明显，但是该策略在BoNTs疫苗 方便的应用几乎很少。本研究针对这一问题，利用基因工程手段使与肉毒梭状杆菌同属的产气荚 膜梭菌的plc毒力基因失活，构建了具有较好安全性和稳定性的产气荚膜梭菌减毒株；然后将该 减毒株作为BoNT／ABHc嵌合表达蛋白的口服细菌输送载体，经蛋白质免疫印迹分析，该嵌合蛋 白具有良好的反应原性。本研究为探索和研究新的肉毒疫苗具提供了重要依据，取得主要实验结 果如下： 第一，我们用FTG培养基对实验室现有的产气荚膜梭菌菌株进行复苏，根据文献报道，建 立了针对产气荚膜梭菌各个主要毒力基因的多重PCR检测方法，对现有产气荚膜梭菌的主要毒 素基因进行了检测和分析。然后，结合其生长特征，为构建产气荚膜梭菌减毒株挑选出一株不产 生CPE、B、￡和I毒素的野生型产气荚膜梭菌作为后期实验菌株。 第二，对上述实验菌株的础基因进行PCR扩增和测序，将测序结果在GeneBank中进行Bl ast比较分析，从中选取较为保守的596 bp片段，设计plc基因阻断位点。针对plc基因阻断位点， II II 构建groupintron供体质粒pJIR750ai-CG，使groupintron特异性阻断plc基因的表达。经观察 卵磷脂反应和溶血反应，以及蛋白质免疫印迹分析，证明ptc基因减毒株丧失表达a毒素蛋白的 转接到产芽孢的DS培养基中培养，经芽孢染色、镜检，证明plc减毒株形成芽孢的能力较好， 与野生型无差异，且没有恢复pfc毒力的趋势。 kDa的嵌合体BoNT／AB 第三，设计并合成了A型肉毒毒素重链和B型肉毒毒素重链各50 ORF的穿梭型质粒pJRC200上。经电穿孔转化、菌落PCR筛选， Hc，将其连接到一个具有cpe 最终获得能够表达BoNT／ABHc的产气荚膜梭菌plc减毒株。蛋白质免疫印迹分析结果表明，成 功构建和表达了嵌合体BoNT／ABHc，该嵌合体具有良好的反应原性。 基于以上实验结果，我们为研发以产气荚膜梭菌减毒株作为抗原输送载体的口服疫苗奠定了 坚实基础。 关键词：肉毒毒素，肉毒中毒，产气荚膜梭菌，口服疫苗，黏膜免疫 Abstract withother neurotoxinisoneofthemost Historically,comparedbiologicalagent,Botulinum biotoxinintheworld．ithasattractedclosed wehave important very publicattention．Nowadaysgood achievementsinscientificresearchofthedetectionofBoNTandthe we gene diagnosisofbotulism，but stilldon’thavea vaccineto theinfectionof ofliveattenuated perfect prevent BoNTs．Recently,use for isa vaccine withobvious bacterial舔ealTier a