microRNs芯片筛选BMSCs神经分化过程中调控Tau蛋白表达的micro RNAs.pdf

摘要 micro RNAs芯片筛选BMSCs神经诱导分化 RNAs 过程中Tau蛋白表达的micro 摘 要 背景介绍 骨髓间充质干细胞(Bone StemCells，BMSCs)是来源于中胚 Mesenchymal 层的成体干细胞，因具有多向分化能力，如脂肪细胞，软骨细胞，肌细胞，神 经细胞等，而被人们期望应用临床治疗。但我们对其多向分化潜能的认识，多 集中于在表面标志物的表达，对于其机制则缺乏深入的了解。基因组学的研究 结果表明，各种正常细胞核内拥有的基因量相同，那么其表型和功能的差异就 取决于基因表达的差异。表观遗传学所解释的就是相同的基因型是如何产生复 杂表型的，主要包括DNA甲基化，组蛋白修饰，染色质重塑及microRNA调控四 --25个核苷酸组成，通常与一个或者多个mRNA的特定靶点结合，在翻译水平的 通过抑制或断裂靶标mRNAs而调节基因的表达。 Tau蛋白属于微管结合蛋白，在中枢神经系统中广泛分布，主要存在于神经 元中，在其它组织中很少表达或者不表达。Tau基因位于染色体17q21，由跨越135 kb的16个外显予组成。其中外显子2，3，lO可被选择性剪切而形成存在于成人 脑内的六种异构体。在健康成人脑内，Tau蛋白具有启动微管装配和稳定微管网 络的作用，并与神经细胞信号转导和物质运输相关。由于Tau蛋白的表达量、异 构体类型和磷酸化修饰程度均随着神经发育发生改变，这种时间和空间调控的 方式提示Tau蛋白与神经发育相关。随后人们发现反义核苷酸抑制Tau蛋白表达 后，体外培养的神经细胞不能生长轴突，Tau基因敲除鼠胚胎海马的神经干细胞 在体外培养时显示出明显的轴突和树突生长延缓。现在普遍认为Tau蛋白对神经 发育具有重要作用，参与轴突、树突生长和神经细胞极性形成，后者是神经细 胞发育成熟的重要特征之一。 摘要 本实验室在研究BMSCs的分化潜能时发现，在未分化的BMSCs中不能检测 到微管相关蛋I刍Tau的表达，当其被诱导向神经细胞分化过程中则伴随有神经特 异性微管相关蛋EtTau的表达显著增高。由于BMSCs在分化过程中的DNA序列并 未发生改变，因此可从表观遗传学的角度来研究骨髓MSCs向神经细胞分化过程 中miRNAs的变化并进一步探讨Tau表达的相关miRNAs调控。 方法 体外分离SD大鼠骨髓间充质细胞，通过贴壁培养使细胞纯化，传至第三代 时分组：诱导组和对照组。诱导组在传代24h后加入碱性成纤维生长因子(bFGF) 预诱导24h，浓度10 ng／ml，然后全量换液，使用含有2％-甲基亚枫(DMSO) 不施加任何影响因素，其他步骤与诱导组相同。收集细胞后，每组各取两瓶， ml 弃去培养基直接加入Trizol(1Trizol／10cm2)，反复吹打至细胞层完全溶解， LNA v．14．0)检测两组 干冰运输送检，使用miRNAs芯片(miRCURYTMArray time 的MAPT基因为靶标的miRNAs，并随后用realPCR技术确认其表达变化。最 后通过real 变化情况。 两组细胞分别用免疫细胞化学法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)，进行 神经细胞鉴定；分别进行westernblot检测Tau在诱导前后表达量的变化。 miRNAs数据分析采用：1．低密度筛选及数据标准化，低密度筛选后，原始 信号密度用中值法标准化(挑选所有样品中密度50的miRNAs来计算标准话因 子)；2．差异超过一定数值的信号才能通过筛选。 仕电 二日7卜 (1)BMSCs被诱导后表达NSE和Tau； 下降(1．5倍)，14个miRs明显上升(1．2倍)； (3)miR．291a．5p和与其同簇I拘miR．294可能参与Tau蛋白的的表达； (4)real．time