MiRNA-24参与小鼠卵泡发育调控作用的研究.pdf

摘 要 摘 要 转化生长因子β(TGF-β) 超家族成员在哺乳动物生殖过程中发挥非常重要 的作用，包括影响卵泡早期发生、颗粒细胞增殖和分化、卵母细胞成熟、胚胎着 床以及妊娠维持等一系列生殖事件。TGF- β信号通路异常会导致雌性不育。 MicroRNAs (miRNAs)是最近发现的一类小的非编码RNA，主要通过转录后的调控 方式抑制或促进基因表达。然而，目前关于miRNAs参与介导TGF- β在生殖过程中 的作用未见报道，如对颗粒细胞增殖和激素分泌以及COC扩展等的影响。在本研 究中，我们首先检测了TGF- β1刺激小鼠腔前卵泡颗粒细胞的miRNAs表达变化情 况，结果发现其中有3个miRNAs显著上调，13个miRNAs发生显著下调。在所有上 调的miRNAs中，miR-224是其中第二个上调最为显著的一个miRNA。这种上调效果 可以通过在颗粒细胞培养基中加入SB431542而阻断，其中SB431542是一种能够阻 断TGF β下游Smad2/3发生磷酸化的抑制剂，表明TGF- β1促进颗粒细胞miR-224 的上调至少部分是通过经典的TGF- β/Smads信号通路。通过对 miR-224靶基因的 筛选，我们鉴定出smad4是miR-224的一个靶基因。在颗粒细胞中过表达miR-224 可以增强TGF- β1对颗粒细胞增殖的促进作用，这种作用至少部分是通过靶向于 smad4实现的。而使用miRNA抑制剂将内源性的miR-224水平敲低则可以部分抑制 TGF- β1对颗粒细胞增殖的促进作用。此外，我们发现miR-224和TGF- β1都具有 影响颗粒细胞雌二醇分泌的功能。通过real-time PCR分析表明，miR-224和 TGF- β1促进雌二醇分泌的作用可能是通过促进cyp19a1基因表达实现的。这是首 次发现miRNAs可以通过参与TGF- β1对颗粒细胞增殖和卵巢雌激素分泌而实现对 生殖过程的调控。 通过对TGF- β1刺激小鼠颗粒细胞的mRNA表达谱分析，我们发现大量mRNA表 达水平发生显著变化，其中463个mRNAs显著上调，440个mRNAs出现显著下调。在 上调的mRNAs中，上调最为显著的一个基因是ptx3。考虑到ptx3是COC扩展的一个 标记基因，所以推测TGF- β1可能会通过调节Ptx3的表达参与卵泡后期发育。所 以，ptx3基因成为我们的研究重点。在对ptx3 3’UTR片段的分析中，我们意外 地发现此前研究的miR-224在其中具有保守的结合位点。随后通过荧光素酶报告 基因检测和酶联免疫吸附实验都证实ptx3确实是miR-224的靶基因。进一步的研 究发现，在小鼠壁层颗粒细胞和卵丘细胞中，TGF- β1同样促进了ptx3的表达， 但却抑制miR-224的表达。通过分离COC进行体外培养，我们发现TGF- β1促进了 卵丘扩展四个标记基因（ptx3, ptgs2, tnfaip6和has2）的表达水平，提示TGF- β1 可能与卵丘扩展有关。所以，我们推测TGF- β1可能正是通过对miR-224和ptx3 表达的精密调节从而实现对卵泡发育过程的调控。然而对于miR-224是否通过对 ptx3表达调控进而影响COC扩展、受精及胚胎发育等都有待于进一步研究。 I 摘 要 综合以上研究结果，我们认为miR-224正是通过靶向于不同的靶基因实现 TGF- β1对卵泡发育调节的介导作用。而对miRNA参与卵泡发育过程的进一步研究 将会为人工干预生殖过程提供研究基础，如治疗生殖紊乱等。 关键词： microRNA-224 小鼠 卵泡发育 细胞增殖 COC 扩展 II Abstract ABSTRACT Many members of the TGF-β superfamily are indicated to play important roles in mammalian reproduction, such as affecting t