murA基因对枝杆菌生长相关性在研究.pdf

murA基因对分枝杆菌生长相关性的研究 硕士生姓名： 吴冬婷 指导教师： 马郁芳教授 指导小组： 辛毅教授 专业名称： 生物化学与分子生物学 摘 要 结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，Ta)是一种具有致病性的病原菌， 它所引起的具有传染性的结核病已成为对人类健康最大威胁之一。目前，由于多 重耐药性菌株的出现，使结核病的发病率在全球范围内呈上升趋势。因此，当前 寻找能有效对抗这种病原菌的药物靶点，并以此来研发新型抗结核病药物已成为 试图控制结核病蔓延的研究重点。 分枝杆菌细胞壁的核心结构mAGP(mycolic 肽聚糖是维持菌体细胞形态和渗透压平衡的结构基础。肽聚糖是N．乙酰葡糖胺和 N．乙酰胞壁酸交替连接形成的多糖链再与短肽交叉连接形成的网状大分子结构。 其中，N．乙酰胞壁酸以UDP．乙酰胞壁酸作为糖基供体，而UDP一乙酰胞壁酸的合 成途径由两个酶(MurA和MurB)催化完成。在哺乳动物中不存在N．乙酰胞壁酸， 所以，不存在UDP．乙酰胞壁酸代谢途径。因此，MurA和MurB可能是抗结核药 物的作用靶点。 31 本课题组已鉴定了结核分枝杆菌Rvl5是编码UDP-N．乙酰葡糖胺烯醇丙酮 转移酶(MurA)的murA基因，催化UDP．乙酰胞壁酸生成的第一步反应。为了研 究murA基因对分枝杆菌生长相关性，本课题利用与结核分枝杆菌具有相同细胞 壁结构，但无致病性的耻垢分枝杆菌(Mycobacterium 为实验模型，构建murA基因敲除菌株。 本论文的研究目的：(1)采用同源重组插入突变的方法构建耻垢分枝杆菌murA 基因敲除菌株；(2)在不同条件下对该菌株进行培养，绘制该菌株生长曲线，从而 确定murA基因对分枝杆菌生长的相关性。 本论文获得的结果： 1．MsmmurA基因的扩增与克隆 chain 55基因组中扩增Msm 利用PCR(polymerasereaction)技术从mczl murA基因及其上游约463 bp的DNA序列，并将其连接到pMDl8．T的克隆质粒 murA murA。经DNA序列测定，将测序结果与已知的Msm 上，构建出pMD-Msm 基因进行相似性比较，结果显示出扩增的基因为目的基因。 murA：：kanK的构建 2．条件性复制质粒pPR27．Msm murA中的特 将来自于pUC4K的kallR抗性片段插入到克隆质粒pMD．Msm 定位点，产生Msm似：：k觚R突变基因。再将MsmmurA：：kanR突变基因克隆 murA：：kanR，该质 到pPR27．xylE质粒，从而构建出条件性复制质粒pPR27．Msm 粒具备pPR27．xym质粒的性质。 murA的构建 3．营救质粒pCG76．Mtb murA基 murA质粒中获得膨tuberculosis 从本实验室构建的pET29b-Mtb murA片段。将 因，将该基因插入到pET23b-Phsp60质粒中，获得Phsp60．Mtb murA，该质粒具备 该片段克隆到pCG