中国美利奴细毛20号染色体MHC区段ClassⅡb延伸区域contig搭建.pdf

摘 要 目的：绵羊是我国和世界上最有经济价值的家养动物之一。中国美利奴细毛羊更是我国优良的种质 资源和经济物种。绵羊基因组主要组织相容性复合体（MHC ），又叫绵羊白细胞抗原（Ovine Leukocyte Antigen, OLA ），包含众多紧密连锁的免疫应答和调控基因，这些基因与动物抗病性以及疾病的易 感性等密切相关。因此，对 MHC 区段的特征与功能研究至关重要。对该区段研究而中国美利奴细 毛羊基因组 BAC 文库已经建好，并且 MHC 区段最小重叠度(Minimal Tiling Path, MTP)物理图谱已 经搭建好，并完成测序以及对该区段进行了基因、重复序列以及 microRNA 等的预测，但是在 MHC Class II a 与 MHC Class II b 之间因为染色体倒位存在一个大的 gap 。而这个gap 所在区段的遗传连 锁研究表明，是由于常染色体片段倒位产生，它将 MHC Class II 区域分割成两个不连续的区段：Class II a 和 Class II b 。2009 年 4 月牛的全基因组序列公布，为绵羊基因组（特别是与牛相似的倒位区域） 的研究提供了宝贵而丰富的资源。因此本研究的目的就是要根据牛的基因组序列和比较基因组学原 理，利用 PCR 方法筛选中国美利奴细毛羊基因组 BAC 文库，最终利用有效阳性 BAC 克隆构建绵羊 基因组 MHC Class II b 延伸区域的 MTP 物理图谱，为绵羊基因组 MHC 区段倒位区域 MTP 物理图 谱的一部分，进一步推动该倒位区域的研究，并推进整个绵羊基因组 MHC 区段完整的 MTP 物理图 谱的构建，为今后的对绵羊的基础研究奠定基础。 方法：首先，通过比较基因组学方法，根据已公布的牛（Bos Taurus ）的基因组序列，选择位于BoLA Class II b 延伸区域的一些有效 Markers/Symbols ，并据此设计引物。然后，利用PCR 方法从已有的 中国美利奴细毛羊基因组BAC 文库中筛选出候选的阳性 BAC 克隆并进行限制性酶切指纹图谱分析 (Fingerprinting Analysis)，搭建出初步的克隆重叠群（contig ）；然后，对阳性BAC 克隆进行末端测 序，并据此设计 BAC 末端引物，对克隆间的重叠关系进行 PCR 确证，最终绘制出中国美利奴细毛 羊 OLA Class II b 延伸区的 MTP 物理图谱。 结果：（1）根据牛的基因组图谱，设计了26 对用于文库筛选的候选 PCR 引物，最终条件优化好的 可用于 PCR 筛选的引物为 23 对；（2 ）制备了已有基因组BAC 文库的一（初）级 384 孔板混合池 和二（次）级行混合池；（3 ）通过PCR 方法筛选出 58 个阳性 BAC 克隆，并进行了限制性酶切指 纹图谱分析和克隆间重叠关系的 PCR 确证，最终选择 25 个有效 BAC 克隆绘制出了 OLA Class II b 延伸区的 MTP 物理图谱。 结论：（1）利用牛的BoLA Class II b 延伸区的一些 Markers/Symbols ，通过PCR 方法能筛选出阳性 BAC 克隆，不仅说明绵羊与牛在该区域的基因组序列同源性很高，而且证明运用 PCR 方法进行基 因组BAC 文库筛选是快速而行之有效的。（2 ）在本研究中有3 对根据牛的基因组序列设计的引物 没有从绵羊基因组中扩增出 PCR 产物，此外，在多处区域发现了两个或三个不同的 Markers 筛选出 同一个 BAC 克隆的现象。此结果暗示，绵羊与牛之间在以后的平行进化过程中，该区域的局部基 因组序列也许发生了丢失。（3 ）绵羊基因组该区域MTP 物理图谱的构建，推进了绵羊 MHC 区段到 位区域 MTP 物理图谱的构建，不仅充实了绵羊基因组信息，而且可以大大地促进整个绵羊基因组 测序和反刍动物基因组比较研究。 关键词：绵羊；主要组织相容性抗原复合体（MHC ）；OLA Class II b 延伸区域；物理图谱 I Abstract Object: The sheep is one of the best economic valued domestic animals in the world and China. Especially the Chinese