人参皂苷转化菌GsBt3的筛选及其转化西洋参总皂苷的研究.pdf

论文题目：人参皂苷转化菌株C娼Bt3的筛选及其转化西洋参总皂苷的研究 学科专业：微生物学 学位申请人：钟雅婷 指导教师：袁萍高级工程师 摘要 稀有人参皂苷为一类部分去除糖配基的人参次生皂苷，具有很强的抗肿瘤活 性，但是它们在天然人参、西洋参中的含量非常低甚至根本不存在，只有通过酸 碱水解或微生物转化才能形成。微生物转化人参皂苷以其专一性好、异构化衍生 物少、产物种类较少、收率高等优势而成为人参皂苷结构改造研究的主要方向。 本文从实验室保藏的人参皂苷转化菌株中筛选出一株GsBt3菌株，能够将西洋参 总皂苷中的人参皂苷转化为小分子的稀有人参皂苷。 通过考察不同展开剂的分离效果，优选确定了适用于分离分析西洋参总皂苷 转化产物的TLC色谱条件，以氯仿．甲醇一水(40：10：1)组成的展开剂进行硅胶薄层 层析，初步了解西洋参总皂苷转化产物中有人参皂苷Rd、Rga、Rhl和C．K等多 个转化产物形成。经过HPLC流动相梯度的比较研究，建立了定量分析西洋参总 色谱柱：Welehrom mill×250ram，5 C18柱，(4．6 ltm)；流动相：乙腈(A)-水(B) 25_÷40；20～33min，A40—46；33～37min，A46：37-,,45min， 梯度洗脱，0～20min，A 203 nlll：流速：1 mlJmin；进样量：10儿。在此色谱条件下，线性关系考察结 的回归方程分别为y=104．12x+58．728(r=O．9999)；y=l 本法经方法学验证证明简便、灵敏、准确、可靠，对三批西洋参总皂苷转化产物 的分析结果表明，西洋参总皂苷转化产物中人参皂苷R91、I强J、Rd、Rga、C-K 的含量分别为lO．47％、7．26％、19．51％、4．20％和5．78％。 通过微生物转化方法和碱水解方法对西洋参总苷进行转化，再利用硅胶柱层 析分离纯化方法，从西洋参总皂苷GsBt3转化产物中分离得到3个高纯度目的样 品：转化产物AI、BI、CI。从西洋参总皂苷碱转化产物中分离得到4个高 II、BII、CII、D 纯度目的样品：转化产物A II，经TLC和HPLC检测并与对 照品比对，确定转化产物A I、B11人参皂 I、AII为人参皂苷R93，转化产物B I、D 苷C．K，转化产物C II为人参皂苷Rhl。经MS和NMR分析，确定转化产 物C11人参皂苷Fl。 考察了碳源种类、碳源添加量、培养基pH、培养基装量和发酵时间对GsBt3 菌株生物转化西洋参总皂苷的影响，结果表明，GsBt3菌株转化西洋参总皂苷的 最佳工艺条件为：以1％的麸皮为碳源，培养基装量为lOOmL／500mL，培养基初 始pH值为5，28℃，220r／min摇瓶发酵5天。 人参皂苷转化菌株GsBt3的菌落初为白色，48小时开始从菌落的顶端开始 产生褐色孢子，菌落逐渐变为黑褐色。无渗出液。菌落反面呈浅黄色。生理生化 试验证明菌株GsBt3具有纤维素酶、蛋白酶、淀粉水解酶以及p．葡萄糖苷酶活 性，而在凝乳酶和硝酸盐还原等方面表现为阴性。将菌种GsBt3的序列与 GeneBank中已有的序列进行分析比对，同时构建菌种的系统发育树，鉴定的结 果表明菌株GsBt3属棘孢曲霉属。由此鉴定菌株GsBt3归属于子囊菌亚门 aculeatus)。 菌科(Trichocomaceae)、棘孢曲霉(Aspergillus 关键词：人参皂苷发酵生物转化菌种鉴定棘孢曲霉分离纯化 论文类型：b．应用基础 Il Abstract Rare area of which ginsenosidestypesecondaryginsenosidesglycosylligands havebeen more