人源N-乙酰葡糖胺糖苷酶(OGA)的原核表达、催化机理研究及多克隆抗体的制备.pdf

摘要 摘要 O．连接Ⅳ-乙酰葡萄糖胺(O．GlcNAe)修饰广泛地存在于真核生物中，对细 胞质与细胞核内蛋白的Ser／Thr进行单糖基化修饰，与磷酸化相似，是一种广泛、 动态的蛋白质翻译后修饰方式，参与基因转录、信号转导、蛋白质降解等多种 生命活动的调控。O-GlcNAc修饰水平与多种疾病，如II型糖尿病、老年神经退 行性疾病以及和癌症的发生都有密切关系。 蛋白上O-GlcNAc的添加和移除分别是由13-Ⅳ-乙酰葡萄糖胺糖基转移酶 源OGA aa) eDNA基因的三个片段：全长foga(编码1-916aa)，yoga(编码1-677 及soga(编码1-350aa)，并分别连入原核表达载体pET-28a中，在大肠杆菌BL21 菌株中分别进行诱导表达；通过优化IPTG浓度、诱导时间等，找到了最优的诱 导条件，使得各OGA片段的表达量及可溶性都得到了改善。按照优化后的条件 对三种OGA片段进行大规模诱导表达，并通过Ni柱亲和纯化得到了纯度较好 的目的蛋白，能够用于生化研究和酶活测定。 以4．甲基伞形酮．乙酰氨基葡萄糖(4．MU．GlcNAc)为底物，分别测定三种 纯化后的OGA片段的13-Ⅳ-乙酰葡萄糖糖苷酶活性，结果显示三种OGA片段均 端结构域即sOGA是糖苷酶活性中心，能够独立发挥催化功能；C端结构域可 以稳定全长蛋白的三维结构，并对糖苷酶活性的发挥有着重要的辅助作用。但C 端结构域的作用机制仍有待于OGA结构的解析。 确定sOGA具备独立催化能力之后，我们利用已解析的OGA同源结构对其 进行同源建模，得到了sOGA的三维结构模型；通过分子对接，模拟出OGA抑 制剂PUGNAc与活性中心的相互作用模型；并根据该模型得到了7个可能在 摘要 D285。利用定点突变PCR的方法，我们分别对其进行突变：Y69F、D174N、 化和酶活测定，实验结果显示各突变体的活性均较野生型有不同程度(4-2000 倍)的降低，表明各氨基酸均在OGA发挥催化功能过程中发挥重要的作用，该 实验为深入研究OGA的催化机理奠定了基础。 为了进一步研究OGA的体内生物学作用，我们以纯化的sOGA作为抗原， 免疫兔子并通过亲和纯化成功得到了多克隆抗体，westernblotting结果显示制备 的抗体能够特异性识别各种长度的OGA变体，为后续的其他相关生物学实验提 供了可能。 关键词：O-GIcNAc修饰；OGA；优化表达；糖苷酶活性；同源建模：定点突变； 多克隆抗体 II Abstract Abstract 0·linked all essential，dynamic 13-N-aeetyl·glueosamine(O-GleNAc)isprotein translational atserineandthreoninein modifieation residuesthe nuclearand myriad ofall to ratherthan euearyotes．Similar cytoplasmicproteins proteinphosphorylation classical of to membraneandsecreted is proteinglyeos