利用TMV病毒体在烟草中瞬时表达Reteplase初步研究.pdf

摘要 急性心肌梗塞、脑梗塞等血栓栓塞性疾病的致残率和致死率都很高，严重威胁着人类健康及 生命。临床上，以溶血栓为主的溶栓药物疗法是血栓疾病的首选治疗方法。Reteplase(瑞替普酶) 是临床上治疗血栓性疾病的常用药物。Reteplase(瑞替普酶)商品化生产中存在成本高、价格昂 贵等问题，探索和研究新型、简易和高表达量的表达系统，是提高产量、降低成本的关键。与其 它表达系统相比，植物病毒载体表达体系在短时间内、在不影响环境的条件下，可以生产大量成 本低廉的、安全的目的蛋白。最新的蛋白质体表达技术不仅可以提高目的蛋白的产量，还可以解 决植物特有的糖基化修饰问题，甚至可以简化下游纯化技术。现将两种技术紧密的结合在一起， 将为解决Reteplase(瑞替普酶)生产提供一条新的思路。 TRBO—G为“骨架”(Backbone)， 本研究利用DNA重组技术，以烟草花叶病毒表达载体pJL 运用重叠延伸基因(genesplicingbyoverlap 序列克隆到载体的PacI[flJNotI-HF之间。在此基础上，根据不同的设计方案，将rPA信号肽、Prbl 蛋白信号肽、EK序列、HFBI和Zrea-X3等序列插入不同的位置，构建不同策略的烟草花叶病毒表 达载体并在烟草植物本氏烟中瞬时表达且对表达情况进行初步分析。实验结果如下： 1．对人组织型纤溶酶原激活剂截断突变体Reteplase的突变序列rPA．C9中存在的3个变异位点进行 定点突变校正。修正后的序列与FDA批准的溶栓药物Reteplase的氨基酸序列完全一致。 2．构建了5种不同表达策略的Reteplase烟草花叶病毒瞬时表达载体。载体pJLTRBO。sprPA在寄主 植物本氏烟中表达了有生物学活性的Reteplase，最大表达量约为200．6ng／g鲜叶，最佳收取时间是 第6d。初步证明利用植物作为生物反应器生产Reteplase是可行性的。 自身的2个蛋白酶识别位点处；降解过程发生在细胞内部；降解原因可能是由于病毒侵染引起的 寄主细胞蛋白酶水平和活性上升所致。推测TMv病毒载体表达系统不适用于产物对蛋白酶特别敏 感的外源基因直接在寄主细胞质中的表达。 4．融合PB和病毒载体两项技术的Reteplase表达载体，在烟草细胞中没有形成PB颗粒，因而对其 融合产物Reteplase没有形成有效地保护。病毒侵染依然是PB颗粒不形成的可能原因之一。推测 TMV病毒载体表达体系与蛋白质体表达技术不相容，体系也不适合结构异常复杂多肽／蛋白质在 植物中的表达。 5．两个假说(以上结果中3和4)的提出和对其进一步深入研究将会促进人们对植物RNA病毒载 体表达系统的全面认识，进而推动人们对植物病毒载体更加科学和合理地应用。 关键词：Reteplase，烟草花叶病毒表达载体，蛋白质体表达技术，瞬时表达 Abstract Duetothe and acute highmorbidity mortalitymyocardialinfarction，cerebralinf．arctionaIldother thromboembolicseriousthreats disease，are tohumanhealth and isthe methodof thrombolyticdrugtherapypreferred treatmentofthrombotic isa diseases．Reteplase used for treatmentof commonly thromboticdiseasesinthe drug clinical．Commercialof