四种淡水鱼类组白H2B及其衍生抗菌肽HLP-1的基因克隆、特征分析和原核表达.pdf

摘要 水生动物病害的防治问题一直是人们关注的重点，但目前很少有特效的药物能对抗 水生动物病害，抗菌肽的出现给此类问题带来了新的突破。组蛋白H2B及其衍生的抗 菌肽HLPs在鱼类免疫、抗菌方面的研究已越来越被人们关注，此类研究在对水生动物 自身免疫及疾病防治方面具有广阔的应用前景，本研究旨在对组蛋白H2B及其衍生的 抗菌肽HLP．1的序列特征进行分析，为进一步从分子水平上阐明组蛋白H2B及其衍生 的抗菌肽HLP．1的来源及抑菌机制奠定基础，另外，原核诱导表达的研究也对抗菌肽的 生产提供了参考，为组蛋白类抗菌肽的抑菌活性研究及较高抗菌活性的抗菌肽筛选提供 了研究基础。 本研究根据GenBanK中的斑马鱼(Daniorerio)等鱼类H2B基因保守性序列设计 引物，从鳙鱼(Aristichthys nobil)、草鱼(Ctenopharyngodon carpio)、鲫鱼(Carassius bp)，并分别构建了不同鱼类组蛋白H2B基因的质粒载体，克隆载体，获得组蛋白H2B 基因序列。利用DNAMAN软件进行了核酸序列相似性比对，结果显示其同源性高达90％ 以上。通过在线分析软件分析了其编码的不同蛋白质的等电点、分子量、二级结构和三 级结构等相关分析。结果显示：H2B编码的蛋白质分子量在10KDa到15KDa之间； 二级结构预测显示，组蛋白H2B主要由0【螺旋和无规卷曲结构组成；三级结构预测显 示组蛋白H2B含有丰富的0【螺旋结构，含量在50％以上。 本实验通过目的基因及载体PET-32a(+)的双酶切构建了表达载体，并成功转化至大 鲤鱼H2B基因在原核细胞大肠杆菌BL．21(DE3)qb成功表达。 基于鳙鱼、草鱼、鲤鱼和鲫鱼H2B基因，设计引物，扩增组蛋白H2B衍生的抗菌肽 HLP一1基因，通过相关在线网站及相关软件对推导的抗菌肽HLP．1进行了蛋白质基本特 性分析，结果显示：分子量在2KDa左右，含大量阳离子，带正电性；二级结构显示其 蛋白由无规卷曲和0【螺旋结构组成；三级结构显示抗菌肽HLP．1位于组蛋白H2B的氨 基端。 进行目的基因和载体PET-32a(+)的双酶切，然后连接，成功转入感受态细胞 进行了原核表达。 本研究成功克隆了组蛋白H2B基因及其衍生的抗菌肽HLP．J基因，为鱼类的组蛋 白H2B基因及其衍生的抗菌肽HLP．J基因的深入研究提供了基础，并基于所获基因推 导的蛋白序列做了特征分析，为从分子水平上深入研究组蛋白H2B及其衍生的抗菌肽 HLP．1的抑菌机制创造了条件；构建的鲫鱼和鲤鱼组蛋白H2B及草鱼组蛋白H2B衍生 并经电泳分离到目的蛋白，为今后筛选高活性抗菌肽提供了研究基础。 关键词：组蛋白H2B，抗菌肽HLP．1，基因克隆，特征分析，原核表达，鱼类 II ABSTRACT Withtheincrease of toleranceof drug bacteria,specially，forbeen morc antibiotics，haspaid a仕cntions in thenew effective practice·Therefore，screeningantimicrobial the ofthe drug，takingplace traditional antimicmbial thefocusof drug，become current in studyaquaculture．Antimicrobial an peptides