单环刺螠纤溶酶基因的克隆及其在酵母中的表达.pdf

单环刺蜢纤溶酶II基因的克隆及其在酵母中的表达 摘 要 血栓性疾病一直严重威胁着人类的健康。据相关资料显示，全世界每年有 1750万人死于心脑血管病，我国心脑血管疾病患者已经超过2．7亿人，每年死于 心脑血管疾病的患者多达300万，已成为心脑血管病发病和死亡最严重的国家。 应用溶栓剂进行溶栓治疗是当前治疗血栓性疾病的主要手段。目前临床应用的溶 栓药物虽然已经发展到第三代，但很多药物存在着特异性差，副作用重，半衰期 短及生产不易等缺点。因此，对于溶栓特异性好，半衰期长，生产制备容易的溶 栓剂的开发需求迫切。 本实验室经多年研究，从海洋无脊椎动物单环刺蜢(Urechisunicinctus)中 分离出了一组新型纤溶酶，命名为单环刺嗌纤溶酶(UFE)，其中包括4个不同 分子量的组分，按照分子量由大Nd,，分别是单环刺蜢纤溶酶I(分子量45k_Da)， 单环刺蜢纤溶酶IV(分子量8-101d)a)。4个单环刺蜢纤溶酶组分均具有提高受试 机体继发性纤溶活性的能力，具有显著的抗凝活性和纤溶活性以及较好的生物安 全性，具有较大的开发价值，但以直接从生物体内分离纯化的方法进行生产存在 许多弊端，如生产工艺复杂，生产质量不稳定，产率低等。故期望通过本研究克 隆得到单环刺蜢纤溶酶II基因，并构建出能够产生重组单环刺蜢纤溶酶II的基因 工程菌株。本研究的主要内容如下： 1． 通过对单环刺嗌纤溶酶II进行蛋白质N末端测序得到了该酶N．末端氨基 酸序列，根据该氨基酸序列设计简并引物，经3-RACEPCR获得该组分 蛋白质的部分编码序列，进一步通过5-RACEPCR获得单环刺蜢纤溶酶 1I基因的全长cDNA编码序列(共906 bp)，其中开放阅读框长度为795bp。 咖口全长cDNA序列经BLASTx比对，结果表明该基因编码产物与丝氨 分析得出，该蛋白质含有一个trypsin CDD数据库中分析结果显示该酶是一种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。 2．成功构建分泌型表达质粒pPICZaA．ufe 1317一 11．P1／P2，以及pINA 菌进行了转化，经过对大量阳性转化子的反复筛选没有检测到产生具纤溶 酶活性蛋白质的菌株。将透析后的发酵上清液经冷冻干燥进行浓缩，通过 SDS．PAGE对样品进行检测未见明显的目的蛋白表达条带，通过免疫印迹 的方法同样没有显示有目的蛋白表达。实验结果表明该基因未能在上述三 种酵母宿主菌中表达目的蛋白。 综上所述，本研究通过分子生物学的一般方法克隆得到了单环刺蜢纤溶酶II 基因的全长cDNA编码序列，通过生物信息学手段对该基因进行了分析，得出 该基因编码产物是一种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，理论分子量为23905．85Da； 成功构建了表达载体，分别对三种酵母宿主菌经行了转化及筛选，为今后对该酶 及该基因进一步深入的研究奠定了基础。 关键词： 单环刺蜢纤溶酶；基因克隆；基因表达；巴斯德毕赤酵母；解 脂耶氏酵母 and in ofcDNA Molecular yeast expression cloning Urechisunicinctus 11 Enzyme Encoding Fibrinolytic Abstract the aseriousthreattohuman tosome