家蚕和果蝇的抗肽Cecropin B基因的表达及产物抑菌活性分析.pdf

摘 要 抗菌肽 Cecropin B 是一种线性多肽，分子量约为 4kD ，在疏水环境中易形成两亲 性(Amphipathic)α-螺旋，具有热稳定性，水溶性好。Cecropin B 具有抗细菌、抗真菌 等作用，近年来发现还有抗肿瘤及抗艾滋病病毒的活性，引起了国内外研究者的广泛 关注。从生物组织中分离获得大量抗菌肽难度大，人工合成成本高，因此利用基因工 程的方法表达抗菌肽成为近年来的研究热点之一。 本研究构建了原核和真核表达载体，在大肠杆菌中表达家蚕（Bombyx mori ）和果 蝇（Drosophila melanogaster ）抗菌肽Cecropin B2，并比较了两种抗菌肽的活性。 同时也在昆虫杆状病毒体系中表达了家蚕（Bombyx mori ）抗菌肽Cecropin B2。获 得以下主要结果： 1．根据大肠杆菌基因翻译偏爱的密码子，分别对其进行优化后，并用 overlap extension PCR 的方法扩增获得了家蚕和果蝇抗菌肽基因BmCecB2 和 DmCecB2 ，将人 工合成的 PCR 产物与表达载体 pET32a 重组，构建了表达载体 pET-32a-BmCecB 和 pET-32a-DmCec B ，转化E.coli BL21(DE3) ，IPTG 诱导表达。 表达产物经 SDS 电泳和 Western blotting 检测，在预期的相应位置出现了特异的蛋白条带，表明 Cecropin B 基因在 E.coli BL21(DE3)宿主菌中获得成功表达。分离纯化融合蛋白后， 用肠激酶将 N 端的融合部分切除，得到完整抗菌肽，通过沸水煮过后，抑菌实验结 果显示，表达的 Cecropin B 蛋白具有抑菌活性。BmCecB2 和 DmCecB2 表达产物的抗 菌活性存在明显差异： DmCecb2 和 BmCecb2 表达产物的质量浓度为 10 mg/mL 时， 其对大肠杆菌（E. coli ） DH5α 的抑菌圈直径分别为 15 和 8 mm 左右，最小抑菌浓 度分别为 0.05、0.1 mg/mL 。结果说明DmCecb2 的原核表达效率及表达产物的抑菌活 性均明显高于 BmCecb2 。 2 ．采取 Bac-to-Bac 表达系统将抗菌肽 Cecropin B 基因在昆虫细胞中表达，，该 系统具有高效表达、无内毒素污染、翻译后修饰等优势。将家蚕抗菌肽 Cecropin B 基因及连接荧光标记基因的 Cecropin B 分别克隆至杆状病毒转移载体 pFastBacI ，构 建的重组质粒 pFastBacI-BmcecB 和 pFastBacI-BmcecB-EGFP 分别转化大肠杆菌 DH10Bac 感受态细胞，发生体内重组，获得杆粒 Bacmid-BmcecB 和 Bacmid-BmcecB- EGFP 。两种杆粒DNA 在脂质体 Lipofectin 介导下侵染家蚕细胞，获得含 BmcecB 基 因的重组杆状病毒，重组病毒感染Bm 细胞后，表达目的蛋白。在荧光显微镜下，可 以看到转基因阳性细胞带有绿色荧光。超声裂解细胞，抑菌试验结果显示，表达的 I BmcecB 蛋白具有抑菌活性。为今后进一步的实验研究提供依据。 关键词：家蚕，果蝇，抗菌肽 Cecropin B2，原核表达，抑菌活性，杆状病毒表达系 统，基因结构 II Abstract Cecropin B is a small protein with a molecular weight of about 4kD, and it is a water-soluble and heat-stable peptide, which is easy formed in amphipathic α-helix. Cecropin B has many important function