大电导钾离子通C端胞内结构域的表达纯化.pdf

摘要 摘要 本论文主要进行了大电导钾离子通道家族(SLO家族)和与PDZ结构域相 结合的激酶(PBK)两方面的工作。 钾离子通道是一种阳离子通道，它与细胞静息电位的形成具有密切的关系。 在神经组织和兴奋组织中，它决定着兴奋电位的持续时间和兴奋频率。通常的 钾离子通道只受电压调控，而SLO家族不仅受电压调控，还被其他因素如钙离 子，钠离子，氯离子，pH值和磷酸化所调节。另外此家族的单一通道的通透性 (即衡量在一定的膜电位下通过开放的通道流入的电荷的数量)也非常大，这 些特性使得SLO家族在功能上区别于一般的钾离子通道。普遍认为，SLO通道 C末端的两个RCK(调控钾离子通道电导)结构域赋予了SLO家族这些独特的 性质。因此其三维结构的解析和研究，对于阐明其机理至关重要。 我们首先尝试表达人源SLO家族四个成员的C末端结构域，但是却没有得 到可溶性的目的蛋白。随后尝试表达低等种属果蝇SLO家族成员dSL01的C 末端的结构域，通过筛选多种表达条件，最终获得了可溶性表达。但是该融合 dSL01 C末端的～段无规则卷曲去掉后得到dSLOlt基因，其在同样的表达条件 下获得了较大量的可溶表达，且其标签可以被PreScission剪切。经过一系列的 纯化后，得到纯度较高的dSLOlt目的蛋白，但是从纯化结果推测，dSLOlt目 的蛋白是高度聚合的，因此并不适合结晶条件的筛选。 PBK蛋白的表达、纯化和结晶尝试是本论文的第二部分工作。PBK蛋白具 有调控细胞进程的作用，它与肿瘤的发生有关，是治疗癌症的靶目标。因此解 析PBK的三维结构、找出PBK行使作用的关键位点就显得非常地重要。 为了解析有活性的PBK的三维结构，我们用昆虫表达系统中表达了大量的 有活性的野生型PBK和将第9位的苏氨酸突变为谷氨酸的PBKT9E。经过镍亲 200的纯化后得到了高纯度、高浓度的PBK和PBKT9E。 和层析柱、Superdex 但是由于天然和突变体均存在状态不均一的现象，导致不能得到晶体。本部分 工作仍在进行中。 关键词：SLO家族可溶性表达纯化PBK昆虫表达系统 I Abstract Abstract Thisthesisincludes on conductanceionchannel experiments potassium large PDZ (SLOfamily)andbindingl【inase(PBK)． Potassiumionchannelisacationion hasaclose the channd，it relationship、7l，itll rest ofcells．Thecommon ionchannelcan be potential potassium onlyregulatedby whiletheSLOchannelCanbe not butalsoother voltage regulated voltage onlyby by factorssuchas large conductanceisalso is believedthatthe single-channel veryspecial．Itgen