基底刚度对创面合相关细胞的影响.pdf

The Effects of Substrate Stiffness on Cells About Wound Repair A Thesis Submitted to Chongqing University in Partial Fulfillment of the Requirement for the Degree of Master of Science By Wang Yu Supervised by Prof. Wang guixue Major: biology College of Bioengineering of Chongqing University, Chongqing, China April, 2011 中文摘要 摘 要 在创面愈合阶段，表皮细胞首先迁移至受创真皮，内皮细胞形成新的血管， 并用新生毛细血管交联成纤维细胞和巨噬细胞代替由纤维蛋白基质组成的肉芽组 织。接着表皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞开始增殖和成熟，并最终恢复上皮屏 障功能。在创面愈合过程中，创面的刚度发生明显的改变，而力学变化对细胞增 殖、迁移和分化有着调控作用。因此，基底刚度的变化对创面愈合相关细胞的影 响值得探讨。本文采用人表皮细胞（HACAT ）、人脐静脉内皮细胞（HUVEC ）和 成纤维细胞三种创面愈合相关细胞，以不同刚度的硅胶作为基底，将其接种在硅 胶基底上，探索不同刚度基底对创面愈合相关细胞的影响，探索人表皮细胞、内 皮细胞与成纤维细胞对外部力学刺激的应激反应，以期为阐明创面愈合机制，促 进创面愈合提供可靠的依据和参考意见。 本文主要的研究内容和结果为： （1）了解创面愈合过程中刚度的变化，采用不同浓度的硅胶配制不同刚度的 硅胶基底以模拟其愈合过程中的刚度变化，观察硅胶基底表面形貌。结果显示以 16 kPa、20 kPa 、200 kPa 来分别模拟正常皮肤的刚度、创面愈合第7 天肉芽组织 的刚度、创面愈合后期的刚度。扫描电镜观察到不同浓度硅胶基底并未引起表面 形貌的差别。 （2 ）将表皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞接种在三种不同刚度的硅胶基底上。 通过细胞生长曲线、MTT 法和细胞周期检测其增殖情况；用细胞划痕法进行表皮 细胞、内皮细胞和成纤维细胞迁移率的测定。发现在刚度高的基底上表皮细胞、 内皮细胞和成纤维细胞增殖速度更快，且三种细胞的迁移率远远高于低刚度基底 上的细胞。同时发现表皮细胞与成纤维细胞对于基底刚度的变化敏感，而内皮细 胞虽然受基底刚度的影响，但其敏感程度不如表皮细胞与成纤维细胞。 （3 ）应用构建好的整合素β1 小RNA 干扰载体转染表皮细胞与成纤维细胞， 通过瞬时转染，用 Western blot 检测转染后表皮细胞与成纤维细胞整合素β1 蛋白 的改变。通过潮霉素持续加压筛选已转染细胞，直到转染细胞株单克隆形成。通 过蛋白质印迹发现重组质粒siIntegrinβ1 转染表皮细胞与成纤维细胞后，能够抑制 细胞中整合素β1 的蛋白表达。 （4 ）将干扰整合 β1 的表皮细胞和成纤维细胞接种在高刚度的硅胶基底上， 以正常表皮细胞与成纤维细胞作为对照。通过细胞生长曲线、MTT 法和细胞周期 检测其增殖情况；用细胞划痕法进行细胞迁移率的测定。发现在高刚度的基底上 干扰整合素β1 的表皮细胞和成纤维细胞增殖能力和迁移速度与正常表皮细胞和成 I 重庆大学硕士学位论文 纤维细胞相比均有所降低，尤其是迁移速率明显下降。 关键词：基底刚度，创面愈合相关细胞，增殖，迁移，整合素β1 II