四种常见呼吸道毒靶序列富集多重PCR--液相芯片检测方法的建立及初步应用.pdf

摘要 摘要 呼吸道病毒是一组能够通过呼吸道传播引起呼吸系统及其他系统疾病的病 原微生物。呼吸道病毒具有发病急、传染性强等特点，可造成局部暴发和世界大 范围流行，严重影响人类健康。由于呼吸道致病微生物感染后的临床症状大多相 似，缺乏特异的影像学表现，因此病原学证据在临床诊断和流行病监控中十分重 要。但目前的检测方法，如病毒分离、核酸检测、病毒抗原检测和血清学检测等 方法，尚不能满足高效、快速和高通量的要求。本研究选择甲型流感病毒、乙型 流感病毒、呼吸道合胞病毒A和B是传播迅速和致病性的4种常见呼吸道病毒， 亟需高效、快速、特异的诊断方法。 目的： enrich 本研究将靶序列富集多重一聚合酶链反应(targetmultiplepolymerase chain reaction，Tem—PCR)和Luminex液相芯片(multipleanalytesprofiling，xMAP) 技术相结合，建立一种可在单个反应体系中同时检测4种常见呼吸道病毒，包括 和呼吸道合胞病毒B(RSⅦ)基因的快速分子检测方法。 方法： 选择可代表上述4种呼吸道病原体的特征保守基因序列作为靶标病毒序列，根据 RNA模板的碱基序列首先合成DNA片段，将合成的DNA片段克隆到pCR擅It 载体，鉴定重组质粒中靶标序列正确性。 4种病毒 基因进行同时扩增。 3．建立可同时检测4种常见呼吸道病毒的液相芯片杂交反应体系，并评价 其特异性、灵敏性及重复性。 4．收集2013年3月至2014年3月在南京军区南京总医院儿科就诊的以急 性上呼吸道感染为主要表现的门诊和住院患者咽拭子标本。提取病毒RNA备用。 5．应用Tem．PCR联合液相芯片技术对上述咽拭子标本进行IFNA、IFNB、 RSVA和RSVB4种病毒基因检测，分别与单病毒基因荧光定量PCR检测方法及 摘要 xTAG液相芯片法进行比对检测，比较两种方法的检测效能。 结果： 4种靶标病 毒序列的重组质粒，经过测定和稀释，制备了10％105拷贝／吐浓度梯度的重组 质粒DNA。 2．建立了可特异性区分IFNA、IFNB、RSVA和RSVB4种呼吸道病毒的 Tern．PCR联合液相芯片方法，检测数据表明该方法具备了较好的特异性和灵敏 度(可达10拷贝／gL)。 3．单病毒基因荧光定量PCR检测方法与上述建立的快速分子检测方法对临 床样本进行检测，经配对计数的)c2检验两种方法的检测效能无显著性差异，同时 进行一致性检验提示两种检测方法一致性较强且有统计学意义；同时选取部分标 本采用xTAG液相芯片法检测，经统计分析显示两种检测方法一致性较好且有统 计学意义。 结论： 本课题构建的基于Tem．PCR和液相芯片系统的分子检测方法可用于呼吸道感 关键词：甲流型流感病毒；乙型流感病毒；呼吸道合胞病毒A；呼吸道合胞病毒 B；靶序列富集多重．聚合酶链反应；液相芯片技术 Abstract Abstract virusesareaseriesof canevoke Respiratory pathogens，whichrespiratory infection havebeen shownto aroleinthe diseases，and increasinglyplay morbidity and ofelderor are mortality