小鼠Map2k基因区域三个片段的敲除.pdf

·中文论著摘要· 小鼠Map2k6基因区域三个片段的敲除 莉吾 基因敲除技术(GeneKnockout)是一种新型分子生物学技术，是利用DNA 同源重组使细胞中特定的基因失活或缺失的技术。该技术自上世纪80年代末诞生 以来，已被广泛应用于功能基因组学等研究领域。由于小鼠基因组与人类基因组 具有高度相似性，通过该技术构建出来的基因敲除小鼠模型已成为研究人类疾病 强有力的工具和手段。 Generalized Terminalis， 先天性全身终毛增多症(Congenital Hypertdchosis CGHT，MIM ID#135400)是一种非常罕见的人类疾病，俗称“狼人综合征” 龈增生和面部特征畸形，且不受性别、年龄和种族限制，曾一度被认为是一种返 Number 区域拷贝数变异(Copy 并提出该区域内的Map2k6等4个蛋白编码基因为CGHT的致病候选基因，但该 病发生的具体分子机制仍不甚明了，而且病例少、病理组织取材困难等限制无疑 又进一步增加了研究的难度。 作为CGHT致病主要候选基因之一的Map2k6基因，负责编码促分裂原活化 蛋白激酶激酶蛋白。但据文献报道，一名包含有Map2k6基因在内的染色体 17q24．2-q24．3区域微缺失的病人并没有出现CGHT相关的疾病特征。并且， Map2k6基因敲除小鼠模型同样也没有表现出明显的毛发生长方面的异常。但值得 注意的是，目前构建的Map2k6基因敲除模型主要是敲除该基因的编码序列以破 坏其蛋白表达，而针对该基因区域潜在调控相关元件的研究甚少。小鼠的Map2k6 基因位于染色体llqE2区域，通过比较基因组学研究我们发现，该基因区域染色 110,378，469一l lO，387，006有一段表达序列标签(ExpressedSequenceTags，EST)集 中的区域，而此类区域常被认为具有调控基因转录和翻译等重要的功能。 本课题旨在针对上述三个DNA片段分别构建基因打靶载体，并用于产生基因 敲除小鼠胚胎干细胞克隆，进而生成相应的基因敲除小鼠模型。该敲除模型的建 立将有助于了解Map2k6基因本身及其对邻近基因表达可能存在的调控模式，进 而为将来最终阐明CGHT的具体分子发病机制奠定基础。 方法 l、对小鼠Map2k6基因区域进行比较基因组学分析，确定该基因的5’非翻译 区(Untranslated Region，UTR)至内含子l、内含子10以及3。非编码区三段敲除 l10，378，469．1 2007，NCBl37／mm9)，大小分别为 10，387，006(UCSC数据库July 4,568 bp、5,450bp、8,538bp，并在理论上设计针对上述三个区域的置换型基因打 靶载体。 2、以覆盖以上区域的BAC克隆DNA为模板，利用PCR分别扩增三个打靶 载体对应的六段同源臂序列，并按照理论设计的先后顺序分别在基因敲除通用载 体pL452骨架上安装每个打靶载体两侧的同源臂，最终通过测序确认打靶载体的 序列信息正确。 3、复苏小鼠胚胎干细胞系AB2．2和JMSA3，并培养调整到良好的生长状态， 取部分细胞做囊胚注射来验证其多能性(Pludpotency)。然后，利用电穿孔 中，在G418药物筛选后，挑选存活下来并具有良好细胞形态的细胞克隆进行培 养、增殖和保存。最后，提取这些细胞克隆的基因组DNA，利用PCR和Southern Blot的方法从中鉴定出正确的基因敲除细胞克隆。 2 复士蟹 耋目禾 lqE2区位置 l、成功构建针对小鼠Map2k6基因区域、染色体l 小分别为4,568 bp、5,450bp、8,538bp的三个置换型基因打靶载体(分别命名为 KO—l