小鼠Scya1Scya2、Scya12基因的克隆、表达及其表达产物功能的初步探索.pdf

摘要 目的：利用克隆得到小鼠 scya1、scya2、scya12 基因 cDNA 序列，然后构建三种基因的重组毕赤 酵母表达载体，使其在原核宿主菌中得到富集，再转化到毕赤酵母宿主中进行表达并鉴定表达 产物的功能。 方法：用 Trizol 法从小鼠肝脏组织中提取总 RNA ，利用 RT-PCR 技术扩增小鼠 scya1、scya2、 scya12 基因的 cDNA 序列。将扩增产物回收纯化后连入 pGEM-T 载体进行克隆、鉴定、测序。将 T 载体克隆的小鼠 scya1、scya2、scya12 基因 cDNA 序列分别用 EcoRI 和 NotI 、EcoRI 和 XbaI 、 XhoI 和 XbaI 双酶切后定向克隆到 pPICZαA 载体中，构建他们的的重组毕赤酵母表达载体，分 别命名为 pPICZαA/scya1 、pPICZαA/scya2 、pPICZαA/scya12 ，再将其克隆、序列测定、酶切线 性化后，整合到毕赤酵母 X-33 的基因组中，用 PCR 法进行阳性重组子的筛选和表型的分析鉴 定。用 0.5%的甲醇诱导重组酵母菌分泌表达，取培养物上清进行重组蛋白的 SDS电泳检 测。粗提蛋白后进行简单的抑菌实验研究。 结果：1. 完成了小鼠 scya1、scya2、scya12 基因 cDNA 序列在 pGEM-T 载体上的克隆、鉴定和 序列测定，它们的序列测定结果分别与 NCBI 里公布的登录号为 NM_011329-2 、NM_011333-3 和 NM_011331-2 的cDNA 序列一致。 2. 小鼠 scya1、scya12 基因的 cDNA 克隆序列经双酶切、连接到 pPICZαA 毕赤酵母表达载体 后，将连接产物转化到大肠杆菌里，连接产物无法在大肠杆菌中得到大量克隆富集。因此，未 能实现小鼠 scya1、scya12 基因 cDNA 序列整合进酵母基因组进行重组蛋白的诱导表达。 3. 成功构建了小鼠 scya2 基因 cDNA 序列的重组毕赤酵母表达载体，我们将其命名为 pPICZαA/scya2 载体。并将该重组表达载体整合到了毕赤酵母的基因组中进行表达，SDS 电泳可在重组酵母培养物上清中检测到分子量约为 16.6KD 大小的重组蛋白。粗提重组蛋白未发 现明显的抑菌作用。 结论：小鼠 scya1、scya12 基因 cDNA 序列可以在 pGEM-T 载体上稳定存在并进行传代克隆，但 其重组毕赤酵母表达载体无法在大肠杆菌中得到大量传代克隆。scya2 基因重组蛋白能够在毕赤 酵母中得到表达，为大量获得 scya2 基因重组蛋白和对其更多功能的研究奠定了基础。本研究首 次构建了小鼠 scya1、scya2、scya12 基因 cDNA 序列的毕赤酵母表达载体，并且在毕赤酵母菌 X-33 中诱导分泌表达了 scya2 基因的蛋白。 关键词：scya1；scya2；scya12；pPICZαA 载体；毕赤酵母 I Abstract Object: To clone the cDNA sequence of mouse scya1 ，scya2 and scya12 gene in procaryotic host based system and construct their recombination pithia expression vectors ，and express them in pithia pastoris and identify the function of expression proteins. Methods:Mouse scya1 ，scya2 and scya12 cDNA were amplified with total RNA from mouse liver Tissue by RT-PCR then cloned into cloning vector pGEM-T and sequenced.The recombination clonin