干扰素α和人免球蛋白Fc片段融合蛋白的构建与表达.pdf

摘 要 摘 要 基因重组干扰素如IFN-α(IFN-α包括IFNα-2a，IFNα-2b，IFNα-1b等)及其修饰 体（如多价干扰素）已经作为抗病毒和免疫调节类药物，被广泛用于临床，治疗 多种病毒性疾病和抗肿瘤等。所谓天然的干扰素α （IFN-α）是指细胞经过诱导而 表达产生的细胞因子，通过信号传导继而发挥抗病毒、抗细胞增殖和调节免疫应 答作用，然而，作为一个小分子蛋白，IFN-α在血浆中清除的速度比较快，其半 衰期仅为数十分钟，导致在临床治疗中需要重复多次用药才能达到治疗效果。这 样不仅给患者增加痛苦和经济负担，还会出现药物的峰谷现象，难以达到治疗效 果并容易产生副作用。因此，迫切需要探索一系列增长IFN在体内的半衰期的方 法。在本研究中，为了延长IFN-α在血浆中的半衰期，我们利用免疫球蛋白具有 在血液循环中长效半衰期的特性，构建了编码人源IFN α-2b和免疫球蛋白Fc片段 的基因重组融合蛋白。同时，对Fc片段中可诱导细胞杀伤活性(包括ADCC和CDC 活性) 的个别位点进行了改造，以降低免疫球蛋白Fc片段可能导致的副作用。构 建的融合蛋白既能保持干扰素的活性并带有天然的N端，又具有抗体的优越性， 其Fc 片段的CH2,CH3 区域可以用于ProteinA 的亲和层析，为蛋白纯化提供了方 便；而且保留的抗体铰链link部分使两个有效分子之间的功能互不影响。为了进 一步延长融合蛋白在血浆中的半衰期，我们通过定点突变的方式对IgG 的Fc片段 进行改造，使Fc与FcRn结合能力更强。另外，本研究中还采用了新型的甲醇诱 导型酵母表达系统，达到高效和低成本的效果。研究中对表达融合蛋白毕赤酵母 的高密度发酵培养以及产物纯化工艺进行初步探索。经过纯化的融合蛋白，其纯 度可以达到90% 以上，对于后期的蛋白活性检测和临床试验研究提供材料，为将 来的药物开发设计和应用提供良好的前景。 关键词： 干扰素 融合蛋白 半衰期 毕赤酵母 Ⅰ ABSTRACT ABSTRACT The recombinant interferon such as IFN-α (including IFNα-2a, IFNα-2b, IFNα-1b and others) and its modifiers (e.g. multivalent IFN-α) have currently been used in clinic as an anti-virus or immuno-regulatory drug. Actually, natural IFN-α is a cytokine produced by some cells and has the effects of anti-tumor cell proliferation, anti-virus and immune response regulation. However, as a small protein, it rapidly degraded in vivo with a serum half-life less than half an hour, and this makes patients have to accept frequent dosing which increase the pain and economical burden. The peak plasma concentration will bring about side-effects, which is hard to achieve therapeutic targets. In order to extend the serum half-life of the IFN-α, we construct the recombinant gene encoding human interferon-alpha (rHuIFN-α) and im