微生物合成γ-谷氨酸及其分子生物学研究.pdf

中文摘要 摘要 生物可降解材料、药物靶向和缓释材料等可供选择的种类，难以满足日益 发展的环境保护和药物治疗的需要。丫．聚谷氨酸(丫．PGA)因其良好的水溶性、 生物降解性、生物相容性和安全无毒性，以及分子链上具有的高活性侧链羧基， 易于发生交联、螯合和衍生化，在医药、食品、化妆品和农业领域具有广阔的 发展前景和巨大的开发潜力。目前，亟需解决的是如何提高单位产量以降低成 本，并实现对单体组成和分子量的可控性，这就要求从丫．PGA的生物合成途径 进行深入研究。 本研究从发酵食品中分离到4株谷氨酸依赖型和1株非谷氨酸依赖型丫．PGA CDL-1， 合成菌，通过16SrRNA和BIOLOG初步鉴定为：Bacillus licheniformis CD【广19。 B．subtilisCDL-2，B．subtilisCDL广16，B．subtilisCDLl7和B．subtilis 鉴定和分析，结果表明5株菌合成的丫-PGA产物中D．谷氨酸含量在 kD--443 5．80％--33．95％之间，重均分子量‰为347kD，分散度为1．19~1．44。 低D．谷氨酸单体含量、低分子量和分子量分布小的-／-PGA在医药、化妆品和食 品领域具有很大应用价值。 NK-03和谷氨酸非依赖型7-PGA合成菌Bacillussp．LL3产1-PGA进行了深入研 究。首先，采用特异性细菌促旋酶基因gyrA，将Bacillussp．L”进一步鉴定为 B．amylo砌uefaciens FZB42、B．subtilis ATCCl4580、B． 与B．amylo砌uefaciens 168、B．1icheniformis pumilus 具有94．35和94．09％高度同源性，而PgsA差异性较大，只有79．85％一致性。 设计含有pgsBCA基因的表达载体pTrepgs，及pgsBCA、谷氨酸消旋酶基因racE coli JMl09进行表达。在以葡萄糖或【广 的双基因重组载体pTreRP，分别在E 谷氨酸作为底物的LB(含M孑+和IVln2+)培养基进行发酵，结果显示L．谷氨酸 的L-谷氨酸底物供应；当培养基中提供足够的L谷氨酸时，聚合酶催化合成的 中文摘要 y-PGA差距明显缩小，这表明足量的底物供应可能比合成酶催化能力对高产 棒杆菌C ATCCl3032，在C glutamlcum glutamtcum生产L谷氨酸的培养基中 加入IPTG诱导后，可以合成产量为O．69 g／t,、重均分子量(坻)为73071、D． 谷氨酸单体占3％的),-PGA，实现了),-PGA以糖类为底物的“一步法”合成。 以正交设计方法对B．amyloliquefaciensLL3发酵生产y-PGA的培养基配方 进行优化。分析结果表明，蔗糖对试验组影响最大、为最显著因子，最优组合 为蔗糖50 2 0．6 g／L、fNH4)2S04g／L和MgS04g／L，此时y-PGA产量提高了3．2 倍。在此配方基础上进行了30L和200L的体系放大，发酵过程中菌体生长、 L体系培 相对粘度、y-PGA产量和蔗糖利用等过程参数呈现稳态变化，其中200 养44 g／L，接近2 h时3,-PG