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核内Beclin1 的生物学作用 中文摘要 中文摘要 目的：本文旨在探索Beclin 1 蛋白非自噬相关的新功能，试图探讨Beclin 1 蛋 白的核定位机制，及其在细胞核中的生物学作用。 方法：（1）选取c57 小鼠不同发育时间点的肝脏组织，免疫荧光法观察Beclin 1 蛋白在动物发育过程中的亚细胞定位变化。 （2 ）在基础自噬、激活自噬水平的情况下，体外免疫共沉淀法检测 NIH3T3 细胞胞质及细胞核内，Beclin 1 蛋白与PI3KC3 、Bcl-2 的结合情况，试图探究核内 Beclin 1 蛋白的功能是否是自噬相关的。 （3 ）利用Talen 技术体外构建beclin 1 基因敲除NIH 3T3 细胞系。利用流式 PI 染色、细胞计数、Western Blotting 等方法检测Beclin 1 蛋白表达下调对细胞周 期的影响。 （4 ）给予野生型NIH 3T3 细胞γ 射线辐照后，分离胞质及核蛋白，Western Blotting 检测Beclin 1 在细胞胞质及核中的表达情况。 （5 ）利用Overlap PCR 分段缺失Beclin 1 蛋白序列，Western Blotting 检测介 导Beclin 1 蛋白入核的核定位序列。 （6 ）利用核内蛋白Pull Down 技术，结合LC-MS/MS 质谱分析技术，检测在 核内可能与Beclin 1 相互作用的蛋白。 结果：（1）小鼠的发育过程中，随着年龄的增长，Beclin 1 蛋白在肝脏组织细 胞中呈现核定位增加趋势。 （2 ）Beclin 1 蛋白在细胞核中的功能可能是非自噬相关的。 （3 ）Beclin 1 蛋白参与细胞周期调控，在Beclin 1 蛋白表达下调时，细胞周 期被阻滞在G2/M 期。 （4 ）Beclin 1 蛋白与γ 射线引起的DNA 损伤修复有关，在给予γ 射线辐照时， 核内Beclin 1 蛋白在DNA 损伤加剧时呈现表达升高现象，而细胞胞质及总的Beclin 1 蛋白无明显现象。 （ 5 ）分段缺失Beclin 1 蛋白的主要功能域，发现位于 188-241 和267-325 位 的氨基酸序列可能是介导Beclin 1 蛋白入核的非经典的入核序列。 （6 ）体外Pull Down 实验结果显示，Beclin 1 蛋白在核内与DNA 拓扑异构酶 中文摘要 核内Beclin1 的生物学作用 Ⅱβ存在相互结合作用。 结论：Beclin 1 蛋白在细胞核中的功能是非自噬相关的，其在核中的功能可能 细胞周期及DNA 损伤修复的调控有关。 迄今，关于Beclin 1 蛋白亚细胞定位的认识，认为其主要分布于细胞胞质中。 并且主要在胞内参与自噬过程。我们的研究首次发现Beclin 1 在小鼠体内存在发育 相关的核定位现象，这颠覆了我们以往对于这个蛋白的亚细胞定位的认识。并且 我们发现 Beclin 1 蛋白在细胞核中起着非自噬相关的功能，并且我们首次发现 Beclin 1 蛋白在细胞核中可能与Ⅱ型的DNA 拓扑异构酶β存在结合作用。因此， 本研究是一个原创性的发现。 关键词：Beclin 1 ；核定位；发育；细胞周期；DNA 损伤修复 作 者：徐 非 指导教师：王建荣 The Biological Role of Nuclear Beclin 1 Abstract The Biological Role of Nuclear Beclin 1 Abstract Objecti