根癌农杆菌介导IN1基因转化烟草及其转基因外植体培育.pdfVIP

摘要 摘要 近年来，植物基因工程技术飞速发展，转基因植物在很多领域的研究推广 取得了令人瞩目的成绩。植物基因工程中常用的转化方法一般是通过土壤农杆 菌系统、植物病毒系统和DNA直接导入法这三种方法进行。土壤农杆菌转化系 统包括Ti质粒转化系统和融质粒转化系统。Ti质粒转化系统又包括共和载体系统 和双元载体系统。根癌农杆菌转化方式有多种，如活体接种法、共培养转化法、 叶盘转化法等。植物病毒载体系统一般包括单链RNA植物病毒载体系统、单链 DNA植物病毒载体系统和双链DNA植物病毒载体系统。DNA直接导入法通常分 为化学物质诱导法、电穿孔法、脂质法、微注射法、基因枪法和花粉管通道法 等。转基因技术快速发展的同时转基因植物检测技术也在不断地进步和完善， 目前被广泛应用的转基因植物检测方法有三类：整合水平上的检测、转录水平 blot 上的检测和表达水平上的检测。整合水平上的检测通常有PCR检测、Southern 检测和染色体原位杂交检测等；转录水平上的检测通常包括RT-PCR检测、 Northernblot杂交检测等；还有表达水平上的检测通常包括组织化学染色检测、 Westernblot检测、荧光蛋白检测、ELISA检测、叶片涂抹除草剂检测和叶片退绿 检测等。 2004年Broun等第一次克隆出WINl基因与蜡质代谢过程中蜡质基因表达密 切相关，本实验通过转基因技术将WINl基因导入烟草K326，改变其角质膜厚度 和成分，以此来提高烟草K326抗旱、抗病和抗寒等性能。该项研究结果不仅对 认识和揭示植物角质膜的结构功能有重要的理论意义，而且对植物基因工程技 术改良和培育抗逆性强的优良植物品种以及农业生产都具有重要的应用价值。 本实验从野生型拟南芥花蕾中提取总对悄扩增成W1NI基因，以载体雕珊2J『 为中间载体构建出植物表达载体尸删2J一．S!删，形，Ⅳ，，最后将本实验室构建成功 的植物表达载体尸删2，一．S聊v，仍吼r，作为转基因载体，运用根癌农杆菌转化法中 的叶盘法将目的基因WINl转入烟草k326中，在转化的不同阶段筛选出四种最佳 培养基对转化后外植体进行培养：(1)烟草叶盘共培养培养基T1：MS+lmg／L 6-BA+0．1mg／L 6-BA+0．1mg／LNAA；(2)烟草滤菌培养基T2：MS+lmg／L Carb。本实验通过根癌农杆菌介导法将 代培养基T4：MS+80mg／LKan+300mg／L 摘要 RT-PCR检测方法对转基因烟草l【326一代进行检测，最终得出WINl基因已成功导 入烟草K326，获得了转基因烟草K326一代品种。 关键字：外植体，转基因烟草，培养基，转化，共培养，WINl基因，基因 克隆，烟草，农杆菌 II Abstract Abstract Inrecent Plant and years，thegeneengineeringtechnologyrapidly develop remarkableresultswereachievedin areasofthe research．The many transgenieplants madewild resi and st SOon tec