桔青霉素单克隆体制备及三种真菌毒素蛋白芯片检测方法的研究.pdfVIP

摘 要 摘 要 背景：真菌毒素为真菌产生的次级代谢产物，具有致癌、致突变、致畸等多种毒性， 分布在小麦、玉米、饲料及多种食品中，一旦大量进入生态环境，将对动物、人及整个 生物环境产生严重危害，因此倍受全球广泛关注。目前真菌毒素的检测方法主要有理化 方法和免疫检测方法，理化方法灵敏度较高，但操作复杂，仪器昂贵，免疫方法一次只 能检测一种毒素。因此，高通量的蛋白芯片方法将成为食品中真菌毒素快速检测的发展 方向。 方法：本实验先通过抗原制备、抗原鉴定、免疫、细胞融合与筛选等步骤制备桔青 霉素单克隆抗体，然后以桔青霉素(citrinin，CIT)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol， DON)和伏马菌素 B1(fumonisin ，B1)为研究对象，采用间接竞争免疫原理，以荧光信号 为检测信号，确定 CIT、DON 和 FB1 人工抗原的最佳固定浓度、固定方式，抗 CIT、 抗 DON 、抗FB1 三种单抗和 IgG-Cy5 二抗的最佳工作浓度，建立单独检测一种毒素的 蛋白质芯片检测方法。并在此基础上初步建立同时检测三种真菌毒素的蛋白质芯片方 法。 结果：(1)经过三种方法的鉴定，桔青霉素人工抗原偶联成功；(2)通过免疫小鼠制 备杂交瘤细胞株，获得了一株抗桔青霉素单克隆抗体的细胞株；(3)建立了桔青霉素间 接竞争 ELISA ，其IC50 为 96.2 ng/ml, 检测限为 10 ng/ml，线性范围为 10-810 ng/ml；(4) 对大麦、玉米、饲料样品进行添加回收实验，回收率分别为 99-127.1%、75.4-124.5%、 78-108% 。(5)确定了 CIT、DON 和 FB1 人工抗原固定最佳工作浓度，分别为 1:100、1:500、 1:250；三种真菌毒素单克隆抗体的最佳工作浓度为 1:500、1:400、1:4000；IgG-Cy5 二 抗的最佳工作浓度为 1:1000，最佳人工抗原固定条件是25 ℃ 固定 16 h，绘制了三种真 菌毒素竞争抑制曲线，IC50 分别为 63.7 ng/mL、83.5 ng/mL、54.6 ng/mL，线性范围分别 为：10-810 ng/mL、10-810 ng/mL、1.9-125 ng/mL。(6) 绘制了三种真菌毒素同时检测 的竞争抑制曲线，CIT 灵敏度(IC50)为 25.7 ng/mL ，线性范围 10-810 ng/mL，DON 灵敏 度(IC50)为 58.5 ng/mL，线性范围 10-810 ng/mL， FB1 灵敏度(IC50)为 24.9 ng/mL ，线性 范围 1.9-125 ng/mL。 结论：通过制备抗桔青霉素单克隆抗体建立间接竞争 ELISA ，经添加回收试验初步 I 摘 要 验证该 ELISA 检测方法可用于实际样品的检测；根据我国规定的限量标准，初步建立 的同时检测三种真菌毒素的蛋白芯片检测方法满足我国限量需求。 关键词 真菌毒素 单克隆抗体 蛋白芯片 检测方法 II Abstract Abstract Background: A mycotoxin is a secondary metabolite produced by fungus, with the toxicity of carcinogenicity, mutagenicity, teratogenicity and so on. Mycotoxins can appear in many kinds of food, such as corn, wheat and animal feed, and will severely endangers the safety of animals and human beings when t