溶瘤性单纯疱疹毒的生产、纯化条件探索及其在诊断和治疗中的应用.pdfVIP

摘要 摘要 本文的研究工作主要围绕重组溶瘤病毒(重组单纯疱疹病毒I型和II型)在 诊断和治疗方面的应用研究，实验涉及分子克隆、细胞培养、实验动物荷瘤及 治疗、病毒的生产纯化等技术。发现带有GM—CSF的HSV病毒与化疗药物联合应用 治疗肿瘤没有协同作用；带有绿色荧光蛋白(GFP)的HSV病毒在检测循环肿瘤 细胞(CTC)方面具有一定的精度，这种用HS旷阡检测病人体内隐性播散肿瘤细胞的 方法简便且具有较高的敏感性。 一、溶瘤病毒联合奥沙利铂治疗小鼠黑色素瘤 目的用鼠B16一R黑色素瘤动物模型对溶瘤性II型单纯疱疹病毒(HSv2一GMCSF) 联合奥沙利铂的治疗效果和安全性进行评估。方法B16-R黑色素瘤细胞在C57 小鼠中诱导产生肿瘤，分成对照组，单独使用HSV2-GMCSF治疗组，单独使用奥 沙利铂组和HSV2-GMCSF联合奥沙利铂治疗组。结果对照组肿瘤呈指数生长， 治疗组肿瘤直径明显小于对照组。其中，HSV2-GMCSF单独治疗组的治疗效果最 好，其次是HSV2一GMCSF联合奥沙利铂单独治疗组。结论虽然单独使用 抑瘤效果，但上述两者之间的抑瘤效果差别并不是很明显。病毒在肿瘤细胞中 的复制会使肿瘤组织坏死，妨碍化疗药物到达肿瘤部位；而化疗药物对机体的 免疫系统可能存在抑制作用，从而降低溶瘤病毒所激发的机体抗肿瘤免疫反应， 所以合适的给药顺序和配伍方案非常重要，此次研究中采用的是溶瘤病毒和化 疗药物同时期给药的顺序。还需要进一步探索，选出更好的配伍方案和给药顺 序。 二、用表达绿色荧光蛋白的单纯疱疹病毒HSV神快速检测隐性播散肿瘤细胞 目的用表达绿色荧光蛋白的单纯疱疹病毒一一HSvc即建立一种快速检测隐性播 散肿瘤细胞的方法，并检测70例临床样本。方法肿瘤细胞回收方法的建立： 即Ficol1离心收集肿瘤细胞的方法。以外周血为例预实验方法：将人源肿瘤细 胞加入到全血当中，肿瘤细胞的个数设计为O、10、100、1000、10000五个梯 度，用Ficoll分离淋巴细胞层联合用红细胞裂解液裂解红细胞，用HS扩阡感染 收集到的细胞，37℃孵育624 h，然后用荧光显微镜进行观察。临床样本检 摘要 测方法：收集临床样本(外周血3IIlL、胸水或腹水50ⅡlL、脊髓0．5mL、)，用 Ficoll分离淋巴细胞层联合用红细胞裂解液裂解红细胞，用HSvG即感染收集到的 细胞，37。C孵育624h，然后用荧光显微镜进行观察。按照所观察到荧光数目 的多少，用以下符号进行记录： “一”未检测到荧光细胞； “+”卜10个荧光细 胞；“++”11-20个荧光细胞；“+++”20个荧光细胞。结果此方法可以在6．25 ×105的淋巴细胞中检测出10个肿瘤细胞。70例临床样本中有40例呈阳性。结 论实验结果证明，这种用HS旷阡检测病人体内隐性播散肿瘤细胞的方法简便且 具有较高的敏感性。 三、溶瘤病毒HSV2—GMCSF的生产纯化 目的：摸索生产纯化HSV2一GMCSF的条件方法：通过测量病毒滴度，筛选出最 佳收获时间、最佳盐裂解浓度、病毒在37℃下稳定性、病毒在不同pH值下的 稳定性。分别用滚瓶、生物反应器生产病毒，高速离心和分子筛纯化病毒。结 X108 果：滚瓶培养可以使达到的病毒最高滴度为：HSVl—GMCSF(2．3 X107 PFU／mL)，HSVI-GFP(4×107PFU／mL)，HSV2-GMCSF(6．6PFU／InL)，HSV2-GFP (2．3×107 PFU／mL)，每个滚瓶可以收获病毒液30mL。生物反应器生产 HSV2一GMCSF的滴度为4．2×105PFU／mL，每罐可收获2．5L。通过低速离心去除 细胞碎片，高速离心收集病毒的方法可以收获约1／2的病毒。由于实验条件有 限，先冻融，后分子筛分离的病毒滴度很低，未达到预期效果，需要进一步完 善实验设备。在滚瓶中生产时最佳收获时间为88h；最佳裂解液浓度为1M或 1．2