激活标签法构建南芥T-DNA插入突变体库及D-Ala抗性突变体的筛选.pdfVIP

摘要 摘要 随着生物科学的快速发展，以基因生物学功能鉴定为目标的后基因组学 (postgenome)成为基因组学研究的重点，而突变体在基因生物学功能研究中起 着重要的作用，是其研究的重要材料，因而通过构建饱和的突变体库，是基因生 thaliana)， 物学功能研究的最直接而有效的方法之一。拟南芥(Arabidopsis 十字花科(Brassicaceae)一年生草本植物，因其具有一些独特的遗传学及分子生 物学特性(如个体小、生长周期短、种子繁殖系数高、易于人工诱变及遗传转化 等特点)，被作为植物分子遗传学研究中最受欢迎的模式植物，随着其基因组测 序的完成，拟南芥已成为基因生物学功能研究的焦点，但其90％的基因功能仍未 被鉴定。 丙氨酸(alanine)作为蛋白质氨基酸，参与蛋白质的组成，由于其原子空 间的排布位置不同，又有两种构型：D．型和L．型。天然蛋白质的氨基酸构成 都是【，型，而现研究发现D．型氨基酸在植物代谢中受到强烈的抑制，对生 物机体有一定的毒害作用，如D-丙氨酸和D．丝氨酸，或认为反馈抑制或竞争 性抑制，但人们对其相关机理方面的认知尚少，只在植物方面有少许研究。 本实验主要通过构建功能获得型突变体库，从中筛选D．丙氨酸抗性突变 体，进行突变基因定位和克隆，以初步研究其功能。以哥伦比亚(Columbia， C01)野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana)为实验材料，通过激活标签法(用 含有激活标记双元质粒pCB260的农杆菌浸花进行转化)构建了T．DNA插入突 变体库。从中筛选到D．丙氨酸抗性突变体，并通过Tail．PCR方法成功将T-DNA 插入位点的侧翼序列扩增，得到与D．丙氨酸抗性相关的几个候选基因，主要结 果如下： 。 (1)本实验中，以Columbia(C01)野生型拟南芥为实验材料，将构建的双元 载体pCB260转化农杆菌菌株GV3101，利用浸花法(floral dip)大规模侵染转化 野生型拟南芥植株，经除草剂Basta筛选获得具有其抗性的T．DNA转化植株， 目前已筛选到Basta抗性植株总约20，000株，其突变表型主要涉及植株株型、叶 形的变异，花期、育性的改变，及种子颜色的差异等。并对其中表型存在显著差 异的部分突变体植物进行了突变基因的定位及初步的分析。 (2)首先通过D．丙氨酸的浓度梯度实验，确定了D．丙氨酸抗性突变体筛选 激活标签法构建拟南芥T-DNA插入突变体库及D-Ala抗性突变体的筛选 的标准浓度(4raM)。以所构建的T．DNA插入突变体库中的突变体为筛选材料， 并将T2代种子在含3mMD．丙氨酸的MS培养基上复筛，以确定其对旷丙氨酸 的抗性。并发现D．丙氨酸对Columbia(C01)野生型拟南芥的胁迫作用与培养基中 的硝酸盐的含量相关，随着硝酸盐含量的增加，植株生长受胁迫的现象有所减弱。 点分别为位于2号、5号、2号、1号、3号染色体不同基因。而后对感兴趣的突 变体A22和A36做了进步表型上的鉴定，结果发现突变植株对D．丙氨酸具有一 定的抗性，说明其突变基因可能参与了拟南芥植株对D．丙氨酸的抗性。利用三 引物法，对T-DNA插入位点进行了验证，并在T3代中鉴定到纯合突变体体。 关键词：拟南芥；激活标签法；突变体；Tail．PcR；D．丙氨酸 H 摘要 Abstract Withthe sciences，the becomes rapiddevelopmentofbiological post-genomics thefocusof research genomicswhich functionof is identifyingbi