汉坦病毒双启动双基因真核表达载体的构建及其免疫活性的检测.pdfVIP

rllfll J l rll lfllIlllI rillj Y1 目 录 一、摘要 中文论著摘要………………………………………………………………………1 英文论著摘要………………………………………………………………………6 二、英文缩略语…………………………………………………………………………11 三、论文部分 前言…………………………………………………………………………………………………………1日U舌…………………………………………………………………………………………………………1：!2 材料和方法………………………………………………………………………．14 结果…………………………………………………………………………………………………………18 讨论…………………………………………………………………………………………………………27 结论…………………………………………………………………………………………………………29 四、本研究创新性的自我评价………………………………………………………30 五、参考文献…………………………………………………………………………3l 六、附件 综述…………………………………………………………………………………………………………34 致谢…………………………………………………………………………………………………………43 个人简介…………………………………………………………………………．44 ·中文论著摘要· 汉坦病毒双启动子双基因真核表达载体的构建及其免 疫活性检测 目 的 汉坦病毒(hantaan feverwithrenal (Hantavirus)，是。肾综合征出血热(hemorrhagicsyndrome，HFRS) 的病原体。HFRS是严重危害人体健康的急性病毒性传染病，临床上尚无特异性 治疗药物，疫苗的研制及应用是预防和控制其流行的重要措施。Hv病毒的核酸为 单股负链RNA，基因组由L、M、S三个片段组成，分别编码病毒的聚合酶、包 毒的毒力位点、中和性抗原及型特异性抗原位点等多种抗原决定簇，因此M片段 是一个很好的疫苗候选抗原【11。根据血清学检查，引起HFRS的病原体主要是汉 坦病毒的两个亚型即汉滩病毒(HnⅣ)和汉城病毒(SEOV)，但是近年来出现 了很多病毒变异株。传统疫苗制作过程复杂、时问长，其保护作用比较单一、造 价高，且有病毒毒力“返祖”现象，多抗原组分可诱发自身免疫性疾病等缺点，所 以需要研制一种新型高效疫苗。核酸疫苗具有制作过程简单，经济可靠、不接触 病原体、可以精选所需要的基因片段、不表达无关抗原等优点，给Hv疫苗的研 制提供了新的思路。 针对目前一般核酸疫苗免疫原性较低及Hv混合感染的现象，我们在实验中 使用两个启动子、以HTNV和SEOV的M2基因片段为抗原基因，利用反向疫苗学 技术，构建两个启动子头尾相接的顺式和头头相接的反式双价真核表达载体，观 察两个载体能否在真核细胞中表达及其对动物的免疫效果。同时探讨两个启动子 及启动子的排列方式对其免疫活性是否有影响，以期构建出一种多基因高效疫 苗，为HV疫苗的研制奠定基础。 方 法 一、构建pETBlue2．CMl重组表达载体 (一)真核表达元件的获取 参照载体构建方法，设计引物扩增真核表达元件即CMV启动子、多克隆酶 添加合适的酶切位点，根据添加酶切位点的顺序不同，将片段分为正向和反向， 称为正向CMl和反向CMl。将PCR产物琼脂糖凝胶电泳后回收，．20。C保存。 (二)pETBlue2．CMl载体的构建 正向CMl和pETBlue2．反向CMl重组载体。酶切鉴定后进行序列分析。 二、两型M2基因片