特异基因组位点合的GLP-1基因治疗策略——GLP-1融合蛋白持续表达对小鼠能量稳态的调控.pdfVIP

特异基因组位点整合的GLP-1基因治疗策略 …GLP 1融合蛋白持续表达对小鼠能量稳态的调控 摘 要 胰升血糖素样多肽．1(GLP．1)是由小肠黏膜内分泌L细胞合成并分泌的肠 促胰岛素激素。GLP．1的主要作用是在胰腺内，包括血糖依赖性的增加胰岛13细 胞分泌胰岛素和抑制胰岛n细胞释放胰升血糖素；促进胰岛13细胞增殖和再生， 抑制胰岛p细胞凋亡，从而提升胰岛p细胞质量和胰岛p细胞功能。另外，GLP．1 还可以增加外周组织如肝脏和肌肉的胰岛素敏感性，减少肠蠕动，增加饱感和减 轻体重。天然GLP．1在体内的半衰期很短，不足2分钟，这限制了天然GLP—l 在临床的应用价值。因此，目前对GLP．1的研究重点之一就放在了延长其的作 用时间。GLP．1类似物显著延长了GLP．1在体内的作用时间，但是仍然需要每 天或者每周给药。GLP．1的基因治疗，起到了很好的调控血糖的作用，但是在这 些方法中，GLP．1的DNA是仍游离存在于靶细胞基因组外，不能实现GLP-1在 体内长期作用。 腺相关病毒(AAV)是一种非病原性的复制缺陷型人类病毒，能够特异的将 AAVSl位点被证实是一个安全的可用于外源基因整合的位点。所以，来源于AAV 的重组载体，具有不引起转导细胞免疫反应和插入性突变的特点，并能介导转基 因的长期表达。以上特点使重组AAV载体成为目前理想的基因治疗载体。对AAV 的研究发现，其表达的Rep68／78蛋白和基因组中的RBE元件能够有效的介导 AAV的基因组整合。但是由于Rep68／／78蛋白还有基因组复制的功能，重组AAV 病毒载体系统失去了基因组整合能力。所以，我们需要寻找一种新的基因治疗策 略，使重组AAV载体既能有效转染靶细胞，又能将转基因定点整合到AAVSl 位点。 在这里，我们采用了一种非病毒的基因治疗策略：构建2个载体，一个载体 我们设想将这2个质粒共转移进入靶细胞后，短暂表达的Rep78蛋白协同RBE 的方法检测基因组整合。我们的结果显示，GLP．1／Fc以一种Rep78蛋白依赖的 方式整合到293细胞基因组的AAVSl位点。使用肌肉注射及电击的方法将质粒 发现GLP．1／Fc基因整合到转基因小鼠的AAVSl位点，而没有整合到与肝癌密 切相关的插入性突变位点mir-341位点。随着基因组的整合，利用免疫组织化学 方法在DNA注射部位检测到GLP．1／Fc融合蛋白的表达，利用酶连免疫吸收实 小鼠模型，结果证实GLP．1／Fc基因治疗明显延缓了小鼠的体重增长和进食量。 水平恢复到正常水平。并且，GLP．1／Fe治疗显著提升了外周组织的胰岛素敏感 性。以上结果支持我们的研究揭示了一种新的、无明显副作用的、特异基因组位 点整合的非病毒GLP．1基因治疗方法。 关键词：胰升血糖素样多肽．1；肠促胰岛素激素；基因治疗；整合；AAVSl； 高脂饮食；体重 2 Site forsustained specificgenomeintegrationstrategy ● … ●●● ● ● J● ^ Of inmousetor Oetlde-1 expresslonglucagon=like homeostasis controlling energy Abstract incretinhormonewhichis Glucagon—likepeptide—l(GLP一1)is觚important andsecretedintestinalL—cellsin tonutrition synthesized