1.两种蜘蛛多毒素诱饵载体的构建及初步鉴定;2.电压门控钠离子通道嵌合体的构建以及生理活性的检测.pdfVIP

摘 要 第一部分两种蜘蛛多肽毒素酵母双杂交诱饵载体的构建 及初步鉴定 酵母双杂交系统是一种直接在真核细胞内检测蛋白相互作用的 方法，具有灵敏度高和特异性好的优点。自1989年由Fields等提出 并初步建立以来，得到了不断的完善和改进，在细胞生物学，肿瘤 学，蛋白质组学等诸多领域有着广泛的应用。基于此，我们拟用酵 toxin 母双杂交GAL4系统，研究与虎纹捕鸟蛛多肽毒素．4(huwen toxin HI，JZTX-HI)相互 IV，HWTX．IV)和敬钊蜘蛛毒素．3(Jingzhao 白即诱饵蛋白，以期从人心肌细胞eDNA文库中钓取可与之相互作 JZTX．HI通过PCR获得目的基因，利用引物中的酶切位点，将目的 片段酶切后连接于同一组酶切的载体pGBKT7上。从而得到蜘蛛毒 09酵母感受态细胞。经平板观察菌落以及 pADKT7一起转入AHl X．0【．gal滤纸法显色结果说明诱饵融合蛋白不能激活报告基因的转 录，对酵母细胞的生长无毒性作用。同时针对实验中遇到的问题， 总结了几点酵母双杂交实验上的经验，包括：1)酵母菌株，诱饵载 体，滤纸显色法检测报告基因LacZ表达，2)酵母菌株的培养，转 IS 化效率问题，感受态制备，快速转化酵母等。正确构建的 可以进一步采用酵母双杂交筛选与这两种蜘蛛毒素的相互作用蛋 白，为毒素的应用和功能及作用机制奠定了基础。 关键词：蜘蛛毒素；酵母双杂交系统；诱饵载体构建 第二部分电压门控钠离子通道嵌合体的构建以及生理活性的检测 摘要：哺乳动物中发现的9种电压门控型钠离子通道，起主要 功能作用的Q亚基都是有4个结构域组成，而且每个结构域都有六 个跨膜片段。在具有高度的结构同源性的同时，与河豚毒素作用表 现出截然不同的生理活性，因此是研究离子通道蛋白结构与功能关 系的理想模型。 在研究中，我们首次尝试将四种电压门控型钠离子通道的不同 结构域通过基因工程的方法进行改造、构建异源嵌合体。新的离子 通道嵌合体的四个结构域分别由自来源两个不同的离子通道互换后 组成。为探索钠通道嵌合体电生理特征以及改变，采用一种较为直 接的方法就是在体外细胞中，使重组钠通道蛋白表达，并应用膜片 钳技术进行检测，分析钠通道嵌合体的电生理特性与正常钠通道的 差异，以研究离子通道结构与功能的关系。 这一过程分为两步：1，要正确构建携带嵌合体钠通道eDNA的 重组表达载体。2，质粒转染细胞并表达出钠通道蛋白及全细胞膜片 钳分析。成功构建了15个离子通道嵌合体基因表达载体测全序列， 序列完全正确。我们开始进一步进行功能表达研究。我们采用人胚 肾上皮293细胞(HEK293)作为质粒转染的细胞系，使用脂质体作为 转染媒介，分别瞬时转染含有野生型离子通道和所构嵌合体两种质 粒，转染后的3．7日内，应用全细胞膜片钳技术，对瞬时表达的钠 通道蛋白进行检测、分析，以期比较正常野生型与嵌合体的电压门 控Na+通道在电生理特征上有何差异。嵌合体的已转染的HEK239 都没有检测到电流信号，而作为对照组的野生型的navl．5的I．V曲 线和电流稳态失活曲线都正常。 关键词：电压门控钠通道；重组载体；嵌合体 VI ABSTRACT Yeast isadirectmethod detecting two—hybridsystem protein interactionsin cellswith and eukaryotic highsensitivitysp