位点特异性重组FLP的拆分、重建及其在烟草中的重组活性分析.pdfVIP

摘要 位点特异性重组酶FLP的拆分、重建及其在 烟草中的重组活性分析 植物学专业硕士研究生 高江林 导师 罗克明 教授 摘 要 转基因技术自问世以来发展迅速，已广泛应用于现代农业生产中。该技术可 有效地改良作物品质，提高作物产量，减少除草剂、杀虫剂等农药的使用量，已 经给我们带来了巨大的经济利益。同时，转基因技术在解决全球性的能源危机、 生物医学和保障农业的可持续发展等方面也扮演着越来越重要的作用。然而，公 众一直对转基因技术推广应用所带来的潜在生物安全性心存担忧，人类对转基因 技术的利弊争论从未停止过，这些争论和担忧已严重制约着转基因技术的进一步 推广应用，因此，如何让人类在享受转基因技术成果的同时又无须担心其潜在的 生物安全隐患，已经成为当前亟待解决的重大问题。 前人的研究表明，基因删除系统“Gene．deletor，’可有效消除转基因植物中所 有的外源基因，但该技术仍不能应用于杂交作物育种。为了将基因删除系统应用 于大田生产中解决转基因安全问题，本实论文对基因删除系统“Gene．deletor，’进 行了进一步改进，将重组酶FLP进行了拆分，构建了一个可拆分的基因删除系 统，通过转化模式植物—烟草，验证了该系统拆分并重建后仍具有高效的重组活 性。论文具体结果如下： 一、植物表达载体的构建 以含有植物性内含子坍的重组酶FLP编码序列为模板，采用高保真酶进 行PCR扩增，获得重组酶FLP各拆分片段及全长片段，回收测序验证后连接至 分系统植物表达载体，共计12个。并将上述载体通过冻融法导入发根农杆菌 C58C1和根癌农杆菌EHAl05中。 二、转基因毛状根GUS染色分析 通过叶盘法转化模式植物烟草，获得转基因毛状根若干。GUS染色结果显 示，当转化未拆分的重组酶FLP全长编码序列时，可检测到GUS活性，表明 两南大导：硕十学何论文 段后，基因删除系统中含有单独的FLP酶N端或C端时未检测到GUS活性，表 明该蛋白片断无重组活性；而当删除系统中同时含有拆分后的重组酶N端和C 端编码序列，GUS染色发现，转基因毛状根呈蓝色，表明拆分重建后重组酶活 性可以得到部分恢复。 三、转基因毛状根中的分子验证 根据植物表达载体上T．DNA区间序列，设计两对特异性检测引物，用于转 基因材料的分子检测外源基因。PCR结果显示所有载体的T-DNA区间均已成功 导入到烟草的基因组中。 提取含有不同FLP重组酶基因片段的转基因毛状根DNA作为PCR模版， 在识别位点FI玎两端的载体序列设计引物，进行PCR扩增，凝胶电泳检测发 现，当所有GUS染色呈阳性的转基因毛状根中，均可获得一条377 bp的扩增条 带，表明Fl玎识别位点间的所有基因均被删除；而在未发生删除前，采用该引 物，则扩增获得不同大小的扩增条带(目的片段+载体序列)。PCR产物测序结 果进一步说明，在GUS阳性转基因株系中外源基因被准确删除，仅有一个识别 序列FI玎残留。 四、拆分系统删除效率分析 通过对毛状根GUS染色，统计拆分后重组酶系统的删除效率。选取转化后 烟草叶盘上独立的30．50个毛状根进行GUS染色，统计GUS阳性毛状根所占的 比例。对每个转化载体获得的毛状根重复统计三次，获得平均值。结果显示，转 化完整的重组酶FLP时，它可在毛状根中行使重组活性，删除效率达到 37．8％，而存在核定位信号时提高至43．5％；当重组酶FLP被拆分为N端和C端 后，其单独存在时均无重组活性，而将拆分片段构建为双元表达载体后同时整合 至烟草基因组上，重组酶活性得到恢复，其删除效率达到29．4％，与前人的研究 结果相近。而在FLP酶N端和／或C端分别引入核定位信号后，可显著促进重组 酶活性的恢复，其删除效率分别达到57．1％，63．6％和75％。 关键词：基因删除重组酶FLP蛋白拆分核定位信号生物安全 ¨ Abstract of FLP ReConstruction