低温敏感植物白豆中三个脂肪酸去饱和酶基因的克隆与表达分析.pdfVIP

and ofThree CloningExpressingAnalyse fromPhaseolus AcidDesaturases Fatty toCold lunatusLSensitive ADissertation SubmittedtotheCommitteeof Normal Zhejiang University Forthe of Degree MasterofScience Yumei ByZhang Profi by SupervisedYangLing May,2010 低温敏感植物白银豆中三个 脂肪酸去饱和酶基因的克隆与表达分析 摘要 植物对低温的敏感程度与其起源地密切相关，并且起源于温带的植物经过低 温冷驯化后可以获得一定的抗冷能力，而起源于热带亚热带的植物却普遍缺乏这 lunatus 样的能力。白银豆(PhaseolusL．)则是起源于热带美洲的豆科棉豆属植 物。 大量实验证明膜脂的不饱和度与植物的冷适应性关系密切，抗冷植物比冷敏 感植物的膜脂肪酸不饱和度高。生物膜磷脂的脂肪酸组成及不饱和度直接取决于 脂肪酸去饱和酶的种类和数量，通过酶的种类和活性的变化，调节膜脂的不饱和 度进而改变其流动性，以适应外界温度的变化。本研究对白银豆进行抗冷性鉴定， 并克隆了3个脂肪酸去饱和酶基因，分析了低温等逆境脂肪酸去饱和基因的表达 情况，为进一步研究脂肪酸去饱和酶基因的功能以及在植物抵抗低温等非生物逆 境中的作用打下基础。 1．通过表型观察以及用膜相对电解质渗漏率做Arrhenius图，得到白银豆幼 苗生长临界低温为8士10C。对白银豆幼苗进行80C低温处理，研究不同胁迫时间 下叶片中各生理生化指标的应激动态变化。结果表明在临界生长低温下，白银豆 幼苗的生长受到一定的影响，但是通过增加体内氧化酶活性等能在一定程度上抵 御80C低温产生的影响。 2．利用同源序列设计简并引物，先通过RT-PCR的方法从白银豆叶片中克 隆到各脂肪酸去饱和酶基因的保守区域，然后根据基因片段设计RACE引物，利 用RACE技术克隆各基因末端序列，拼接得到3个脂肪酸去饱和酶基因eDNA全长 序列。同时，根据全长序列设计分段引物，以基因组DNA为模板分段克隆，拼 接获得各基因DNA水平全长序列。其中黝D(硬脂酰．ACP去饱和酶)eDNA全长 为1777 bp，ORF为1317bp，编码439个氨基酸，DNA全长为1939bp，包含有一 个内含子。与大豆SAD同源性为86％，但是在进化关系上，白银豆与麻疯树的SAD 510 116 亲缘关系最近。翩仍eDNA全长1 bp，编码372个氨基酸， bp，ORF为l DNA全长为2663 bp，包含有7个内含子。预测为内质网FAD3，负责催化亚油酸 脱氢生成油酸，与大豆中FAD3同源性达91％。白银豆FAD2eDNA全长为1652