尿激酶介导的肿靶向性rhTNF-a融合蛋白纯化及生物活性研究.pdfVIP

尿激酶介导的肿瘤靶向性rhTNF．u纯化及生物活性研究 中文摘要 【目的】 necrosis 肿瘤坏死因子or(tumorfactor-ix，TNF．Ⅱ)是由激活的巨噬细胞产生的 一种多功能细胞因子，其最显著的特征是在体内外直接杀伤肿瘤细胞，是一种具 有潜在应用价值的抗肿瘤生物制剂。随着分子生物学技术的飞速发展，应用基因 工程手段制备高效低毒的hTNF．0【突变体和具肿瘤靶向性的TNF．0【融合蛋白呈现 出较好的应用前景。本实验在前期实验的基础上，通过GST·Bind树脂纯化融合 蛋白，确定纯化条件并测定其比活性，研究其对肿瘤细胞的杀伤作用，初步研究 其诱导肿瘤细胞凋亡情况，为进一步研究打下基础。 【方法】 利用GST·BindResin纯化四种融合蛋白，BCA法测定其浓度，SDS．PAGE鉴 定其纯度：以L929细胞株为靶细胞，MTT法测定融合蛋白细胞毒性和比活性以 33258染色后荧光显微镜观察融合蛋白对肿瘤细胞形态的影响。 【结果】 1．采用GST·BindResin一步法纯化四种融合蛋白，并在柱上用凝血因子 (Factor Xa)切除其上的GST标签，获得纯度95％以上的目的蛋白。确定了融 合蛋白的纯化方案，并柱上用uPA酶切验证uPA对融合蛋白的去封闭效果并获 得纯度为93％的去封闭后融合蛋白。 2．以L929细胞株为靶细胞，做融合蛋白及其去封闭后产物的受体亲和实验， 结果显示：融合蛋白各组相对于标准品毒性都有较大幅度降低，降幅依次为 38．2％、34．5％、2 变体N端受体结合部位有一定封闭作用；uPA酶切后去封闭融合蛋白各组亲和 实验显示除uPA酶切后融合蛋白U3活性升高8．78％外，其他各组均有较小幅度 下降，降幅依次为16．7％、11．24％和6．21％。可知经uPA酶切后融合蛋白U2， U3和U4基本保持了TNF．a原型的活性，说明改造并未对其活性造成较大的影 晌。 X X 后U4的比活性依次为9．9×107U／mg、6．13107U／rag、8．47×107U／mg、6．71 107U／mg、8．77×107U／mg、7．35×107U／mg、10X ×107U／mg。 胞LD50依次为：0．446 ug／ml； ug／ml、0．521ug／ml、0．505ug／ml、0．442ug／ml和0．478 对A549细胞LDso依次为0．27ug／ml、0．315ug／ml、0．291ug／ml、0．274ug／ml和 0．296 ug／ml；对H446细胞LDso依次为0．234ug／ml、0．257ug／ml、0．253ug／ml、 0．238 ug／ml和0．249 外，其他各组LD50均高于标准品LD50。 5．四种融合蛋白均可诱导细胞发生凋亡，荧光显微镜下观察其形态，可看到 较明显的凋亡形态学变化，胞体缩小、胞浆浓缩、核染色质聚集、核固缩。 【结论】 纯化四种融合蛋白，确定了纯化条件；四种融合蛋白及其酶切产物均保持了 原有的生物学活性，进一步验证了uPA底物序列的封闭效果，四种融合蛋白均能 能诱导高表达uPA的肿瘤细胞凋亡。 【关键词】 人肿瘤坏死因子；融合蛋白；尿激酶型纤溶酶原激活剂；蛋白质纯化；亲和 层析；MTT；细胞凋亡； 2 专． Purificationand indentificationof rhTNF-仅 activity tumor-target