抗菠菜乙醇酸氧酶多克隆抗体的制备及其在研究中的应用.pdfVIP

Productionand of Application anti acia0 CeaycolateSe 8pinaIoleraceaGlycolate PolyclonalAntibody Wu Weidong andMolecular Major：Biochemistry Biology School：SchoolofLifeSciences JieXu Supervisor：Professor Date 10 of 3 0111，20 Submission：May 摘要 抗菠菜乙醇酸氧化酶多 及其在研究中 专业名称：生物化学与分子生物学 申请人：吴伟东 导师姓名：徐杰 研究员 摘 要 1．1．3．1 乙醇酸氧化酶(EC 5，GO)存在于过氧化物酶体中，是 光呼吸的一种关键酶，其催化活性依赖于辅酶黄素单核苷酸 (FMN)。本实验室前期研究发现一种富含苯丙氨酸的碱性蛋白， 命名为面具蛋白，这种蛋白与GO紧密结合，使酸性等电点的GO 呈现碱性，并能使GO在SDS．PAGE中向负极迁移，同时在免疫印 迹中引起免疫交叉现象的出现，而且普遍存在于生物界之中。本文 40 通过制备两种抗菠菜GO亚基抗体，即抗菠菜GOkDa亚基多克 隆抗体与抗菠菜GO重组蛋白多克隆抗体，并通过免疫印迹实验验 证抗体的特异性，同时，本文还讨论了免疫印迹中出现的免疫交叉 反应是否受面具蛋白的影响，通过在3％BSA封闭转印膜后与 2％SDS孵育以及在免疫印迹中重复使用转膜缓冲液，进一步论述 面具蛋白能否在免疫印迹中与多种蛋白质相互结合而导致印迹膜 中出现高背景。这些研究结果希望能在另一个角度为以后本实验室 摘要 对面具蛋白的研究方向提供参考。 初步研究结果表明以下结论： (1)、本文分析了从菠菜中提取的GO，证实其等电点大于pH 40 kDa的蛋白条带。DEAE离子交换层析洗脱液中的GO活性分布 与洗脱液蛋白浓度和SDS．PAGE中蛋白条带的亮度成正相关。通过 瑞士生物信息学研究所的ExPASyComputepI／Mw工具计算出菠菜 GO理论等电点为9．16。 (2)、参照已发表的菠菜GOeDNA序列，设计了一对扩增GO eDNA全长的特异引物，通过RT．PCR克隆菠菜GOeDNA，并将该 HTb表达载体上，转化大肠杆菌后成功 eDNA亚克隆到pProEx。M 诱导表达出GO重组蛋白。 40 (3)、抗菠菜GOkDa亚基抗体免疫印迹结果显示，该抗体 特异的识别经SDS．PAGE分离的菠菜GO40kDa亚基，但不能识别 诱导表达的菠菜GO重组蛋白；抗菠菜GO重组蛋白多克隆抗体免 疫印迹结果显示，该抗体既不能识别菠菜GO40kDa亚基，也不能 与菠菜粗蛋白产生免疫交叉反应，但可以识别大肠杆菌粗蛋白。2％ SDS孵育3％BSA封闭后的印迹膜，印迹膜中的杂带没有消失，而 GO40 kDa条带则消