家蚕谷胱甘肽--转移酶BmGSTe4基因的克隆和真核表达.pdfVIP

捅琵 隆和真核表达 细胞生物学专业硕士研究生：刘佳 指导教师： 潘敏慧教授 鲁成教授 摘 要 谷胱甘肽．S．转移酶(GlutathioneS-transferase，GSTs，EC2．5．1．18)是一个多功能的超家族 酶类，广泛分布于动物、植物、酵母和细菌等生物体中。GSTs在昆虫对有机磷、有机氯和拟 除虫菊酯类杀虫剂的抗性中起着重要的作用。农药在害虫防治中起着1F常重要的作用，但随 着大量农药的使用，昆虫抗药性日益加剧，迫使人们不断开发新的农药产品或增加农药的用 量，这不但制约了经济的发展，也给环境带来了严重的负担，影响到了经济和人类的可持续 性发展。 世界上50％以上的农林害虫属于鳞翅目，家蚕作为鳞翅目昆虫的模式生物和重要的经济 昆虫，是目前唯一完成了基因组测序的鳞翅目昆虫。对家蚕GST基因进行研究，不仅能为家 蚕抗性品系的育成提供理论依据，也可为开展鳞翅目昆虫的生物防治奠定基础。本文采用生 物信息学分析方法，依据家蚕基因组数据库和EST数据库信息，预测了家蚕的谷胱甘肽．S．转 移酶基因BmGSTe4，采用RT．PCR方法分析了其组织表达特性并进行了序列分析。利用基因 工程技术，克隆谷胱甘肽．S．转移酶后，通过杆状病毒表达载体系统构建了BmGSTe4基因的真 核表达载体，对BmGSTe4基因进行了真核表达，并对表达产物进行了weStemblot验证和酶活 性测定，获得结果如下： 1．BmGSTe4基冈的克隆和序列分析 克隆了家蚕的BmGSTe4基因，该基因的完整编码区序列长度为654 bp，由5个外显子与 631 949 4个内含子组成，内含子总长度为3 bp，最长内含子为1 bp，最短内含子为214bp。 而C．末端则由6个0【螺旋构成，有一个保守的Ser催化位点。以神经网络启动子预测分析发现， BmGSTe4有1个TATA盒，在上游2500 bp区域内搜寻相关调控元件时，共发现了14个可能 Epsilon家族聚为一‘类。 f‘学f一论正 两南人7≯n91 2．BmGSTe4基因的表达模式分析 检测发现BmGSTe4基冈只在表皮和头部有表达，在其余6个组织中基本不表达，并且在 表皮中表达量较头部表达量高。表明BmGSTe4基冈的表达具有较高的组织特异性。 3．BmGSTe4基冈的真核表达 蛋白条带，结果发现感染重组杆状病毒Bacmid．BmGSTe4的细胞沉淀有一约为27kD左右的 目的特异蛋白条带表达。 4．westerblot验证 kD和14 感染重组杆状病毒Bacmid．BmGSTe4的细胞沉淀经SDS．PAGE电泳完后切取62 l(D之间的胶进行转膜和Westernblotting杂交。在样品检测到杂交信号。表明，目的基因已在 细胞内表达。 5．GSTs酶活性测定 以CDNB作底物，对重组表达蛋白酶进行初步的酶活性测定，结果表明外源表达的GST 蛋白酶具有较好的生物学活性，为BmGSTe4蛋白进一步的功能研究奠定了基础。 关键词：家蚕谷胱甘肽．S．转移酶杆状病毒表达系统真核表达 II !II—i ABSTR、(T II曼曼曼曼曼量曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼舅曼曼皇曼曼曼曼曼!!!!曼曼曼毫皇!!曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼量曼曼曼曼曼皇曼蔓曼曼曼曼曼曼曼曼曼皇 and ofthe eukaryoticExpression Cloning