多环芳烃—菲、降解菌株的分离、降解特性及降解机制研究.pdfVIP

多环芳烃一菲、萘降解菌株的分离、降解特性 及降解机制研究 中文摘要 aromatic 多环芳烃(Polycyclic 有毒性的污染物，对人类健康和生态环境具有很大危害，已被多个国家列为优先控制的 环境污染物。在PAHs的各种降解方法中，微生物降解是其主要降解途径，一直受到人 们的高度重视。 本研究从西安焦化厂附近污染土壤中分离得到两株菲、萘降解细菌A和B，经 16SrDNA测序分析，鉴定菌株A属于不动杆菌属(Acinetobacter sp．)，菌株B属于假单 胞菌属(Pseudomonas sp．)，其同源性均为99％。另有一株菲、萘降解细菌C，为实验 室保存的野生型铜绿假单胞菌PA01。A、B、C三株菌均能以菲、萘为唯一碳源生长， 通过实验对这三株菌的菲、萘降解特性及降解机制进行了测定和研究。 实验确定了菌株最适菲生长及降解的温度、pH培养条件：A、B、C三株菌的最适 菲一致。增加溶氧量可以促进菌株对菲、萘的降解，说明三株菌均采用好氧降解方式降 解菲、萘。实验还表明，对于菲的降解，不同菌株混合培养均优于任一菌株的单独培养， 可能因为混合培养会导致不同菌株PAHs降解酶及相关蛋白产生的相互弥补和促进。表 面活性剂吐温(Tween．80)或曲拉通(TritonX．100)的添加有利于三株菌对菲、萘的降 解，且对菌株A的促进降解作用更为明显。可能是由于表面活性剂提高了PAHs的溶解 度，使其容易进入微生物的降解系统，而假单胞菌自身具有编码生物表面活性剂鼠李糖 脂的rhMB基因，使得外加表面活性剂的PAils增溶作用并不明显。低浓度抗生素四环 素(Tc)和万古霉素(Van)也可促进三株菌对菲、萘的降解，推测是由于低浓度抗生 素可能对菌体某些基因的表达产生了重要的调节作用，如激活假单胞菌编码生物表面活 性剂鼠李糖脂的rhlAB基因的表达。优化菌株的培养条件，在菌体生长和菲、萘降解处 于最佳状态的条件下测定菌株的降解率：两天内菌株A、B和C的最大菲降解率分别为 和90．2％。 1 以菲降解中间产物水杨酸、邻苯二甲酸为唯～碳源进行的三株菌菲降解途径的初步 研究可知，菌株A可能具有水杨酸途径，菌株B、C可能同时具有水杨酸途径和邻苯二 甲酸途径。通过PCR及DNA序列比对对A、B、C三株菌编码菲、萘降解过程中的三 个关键酶菲双加氧酶、萘双加氧酶和儿茶酚．2，3．双加氧酶基因进行了确定：菌株A仅 扩增得到菲双加氧酶基因，可能是因为引物设计的同源性限制及在该菌株水杨酸途径中 邻苯二酚的开环反应可能由儿茶酚．1，2．双加氧酶催化所导致；菌株B和C同时含有三 个关键酶基因。 在PAHs作为降解底物和压力物质的双重作用下，细菌不仅表达PAHs分解代谢途 径中的降解酶，通常还会表达大量降解相关蛋白。以具有较强降解能力的菌株C——铜 绿假单胞菌PA01为研究对象，从分子水平对菲、萘降解机制进行进一步的研究。采用 带有lux报道子载体构建的铜绿假单胞菌PA01全基因组随机启动子库为平台，筛选出 了20个菲、萘降解过程相关基因，通过DNA序列测定和比对进行这些基因的确定。据 推测这些基因的产物可能包括生物分子合成及能量代谢相关蛋白(如基因F、基因G和 基因J)、转运系统组成蛋白(如基因B)、膜相关蛋白(如基因T)及未知功能蛋白(如 基因P)等。在细菌表达的大量降解相关蛋白中，转运蛋白是重要的一类，实验对RND 外排泵基因在菲胁迫条件下的表达进行了研究。结果表明菲对铜绿假单胞菌PA01中5 个RND外排泵基因的表达具有一定的调节作用。由此可知，细菌对PAHs的降解不仅 需要一系列降解基因的参与，更是众多降解相关基因与之同时表达的作用结果。 本研究通过筛选分离菲、 萘高效降解菌株，研究菌株的降解特性，并在分子水平 染的生物修复提供相应的理论依据和治理措施。 关键词：多环芳烃，不动杆菌，铜绿假单胞菌，分离，降解特性，降解机制 II andmechanismofbacteriawith Isol