探针熔解曲线分应用于丙型肝炎病毒的基因分型.pdfVIP

摘要 病毒基因型是丙型肝炎抗病毒治疗方案选择的重要依据，常见的分型方法有 测序分析、反向线性杂交、实时荧光PCR等，不同的方法设计各有优势和不足， C 本文建立了一个荧光PCR结合熔解曲线分析的丙型肝炎病毒(Hepatitis virus，Hcv)分型体系，用以区分中国大陆较常见的Hcv1a、lb、2a、3a、3b、 6a亚型。实验方法如下：一、制备6个内含HCVRNA核心区核酸序列的病毒样 颗粒(HCV假病毒)，分别作为6个HCV亚型的替代物／阳性质控品；二、设计 通用引物扩增出HCV基因组的核心区，并设计荧光探针与各HCV亚型扩增子杂交， 使之得到亚型特异的熔点；三、考察和优化体系的分型能力；四、建立从RNA提 取到PCR产物分析的检测流程，进行标本检测。实验结果：一、制备的6个HCv 假病毒分别包裹了6个HCV亚型基因组核心区序列，且耐受核酸酶降解；二、 通用引物可成功扩增出6个HCV亚型基因组核心区序列，设计的两条荧光探针与 各亚型序列杂交，可得到亚型特异的熔点，从而能够准确区分6个HCV亚型(在 探针检测区有突变的病毒株除外)；三、分型体系的检测灵敏度la、1b、2a、 当两者RNA比例在1：95到95：1之间时可以检出；四、用本方法检测由假病毒 测限为500拷贝，可检出的样本均获得准确分型。两份HCV阳性血清样本(取自 泉州180医院)，其中一份准确分型为1b亚型，另一份未扩增到HCV核酸序列， 可能是标本在储存和运输过程中病毒降解了。实验结果表明，本文建立的方法基 本达到设计目标，可简单快速地区分6个HCV亚型。 关键词：丙型肝炎病毒；基因分型；分子诊断；溶解曲线分析 Abstract Objective： The of C a of跏iViral gen啊pehepatitisVirus(HCV)ispredictor tllerape埘c istobeall Selectionof res】ponse，wtlichiml砷咖tbasis蠡”theantiViral也erapy．HCV or D眦O—LiPA are detenIlined PCR by血e geno锣peslIsually bysequenCing，real—tinle teStetc．Wredescribean forHCV determiIlationreal—timePCR approaCh geno够pe by aIld cuⅣe t0 and6a 1‰1b，2如3a’3bsubt)，pes，wMch nleninganalysisident坶HCV arc commoniIlmailllandCllina． rela：tively Methods： 1． Si)【VinIS-1ike nucleotide ofHCV particles(栅redI矾A)con蛐gsequences RNAwere con呐lsofmesi)【HCV prepared鹪positive sub呻es． 2．Ulliversal incore ofH(、v priII煳werct0锄叩li匆nucleotidesregion designed t