未培养海洋微生延胡索酸还原酶的基因克隆、表达及生化性质鉴定.pdfVIP

未培养海洋微生物延胡索酸还原酶的基因克隆、 表达及生化性质鉴定 摘要 reductase，EC 延胡索酸还原酶(fumarate 1．3．1．6、)，主要催化延胡 索酸还原生成琥珀酸，是很多生物厌氧呼吸系统中的关键酶。该酶广 泛存在于革兰氏阴性菌、兼性厌氧革兰氏阳性菌以及一些绿藻、原生 动物、寄生蠕虫和低等海洋等真核生物中。不仅可应用于多种人类疾 病治疗，且其产物琥珀酸也有广泛的工业应用价值。本研究主要研究 了从广西北部湾海洋微生物宏基因组文库中得到的一个具有延胡索 1 酸还原酶功能的阳性克隆(pGXAR33G)，其携带的外源DNA片段包 含一个可能编码延胡索酸还原酶的新基因，该基因被命名为蒯埘。 通过生物信息学分析表明，fⅣdlA基因含有444个碱基对，编码 kDa。通过 147个氨基酸，理论等电点为5．59，相对分子质量为16．11 与GenBank数据库比对，在核苷酸水平上没有发现已知的基因存在 相似性，但是在氨基酸水平却与一种延胡索酸还原酶(Runella YP slithyformis 在第56—64个氨基酸中，有一个2Fe一2S铁氧还蛋白结合位点，推测 是其保守结构域。 coli 重组后导入到Escherichia 达菌株E．coli 13G。并在最适条件下诱导培 Tuner(DE3)pLacI／pGXAR3 养，得到重组产物蛋白FrdlA，利用镍柱亲和层析技术完成了重组蛋 白的分离纯化，完成了重组蛋白的功能鉴定和生化性质研究。实验结 果表明，目标蛋白的最适反应温度为28℃，最适作用pH为7．0；最 适条件下的酶活力为9．59U／mL，比活力为10．644 U／mg。通过 Lineweaver-Burk双倒数作图法，测得其‰值为0．227mM，Zm觚为 29．94 mM／min，‰at值为12．35 S-I；Zn2+、M92+对酶反应有促进作用， 本研究的成功实施为深入挖掘利用新型高效延胡索酸还原酶提 供新的技术参考和研究模式，对下一步构建高效的基因工程菌具有重 要的理论指导意义。 关键词：延胡索酸还原酶宏基因组诱导表达基因重组基因工 程菌 II GENE AND CLONING,EXPRESSIONENZYMATIC PROPERTIESOFANoVEL FUMARATEREDUCTASE FROMUNCUI』rURED MAIRNE ABSTRACT Fumarate thereductionof reductase(FRD，EC 1．3．1．6)catalyses fumaratetosuccinate and a roleforthe plays anaerobic key respiration of withfumarateasterminal