松材线虫携带的光假单胞菌GcM5-1A过氧化物酶的研究.pdfVIP

摘 要 wiIt 松材线虫病(Pinedisease，PWD)主要通过松褐天牛为宿主传播，是由松褐 天牛携带的松材线虫(Bursaphelenchusxy]uphilus)引起的一种松树毁灭性传染疾 病。Pltq)可以对多种松属的植物造成危害。由于松材线虫病的发生和发展过程中涉 及到松树寄主、媒介昆虫、松材线虫、相关的微生物以及环境条件等多种因素，而 这些因素之间构成了复杂的关系，所以给该病的致病机理研究以及防治工作造成了 难度。本实验研究了松材线虫携带的荧光假单胞菌GcM5-1A的培养液经硫酸铵分级 沉淀后各组分中木质素过氧化物酶(LiP)的活性及各组分对黑松悬浮细胞的毒性。本 文还对GcM5-1A菌株胞外LiP进行了初步纯化，并对纯化后的酶学性质进行了研究。 沉淀组分对黑松悬浮细胞的毒性也很强。GcM5-1A菌株培养液经硫酸铵分级沉淀以 及DEAE-SepharoseFF两步纯化后，其LiP的比活力从0．81U／mg提高到21．30U／mg。 的抑制作用只有15％左右。吸收光谱显示该酶在406nm处有一个Soret峰，加入1 mmol／L Na：S：04后，吸光度出现了明显的下降，但Soret峰没有显著移动。 另外，我们构建了荧光假单胞菌GcMS-1A菌株的基因组文库，并且通过生物活 性测定的方法从文库中筛选出一个产毒素的转化子。我们对核苷酸序列进行了测定， 结果表明该序列含一个1290bp的开放读框。信号分析软件推测N末端有一个36个 氨基酸的信号肽。同源性分析显示，毒素基因的核苷酸序列与Pf／UOYeSCCnSSBW25 的PFLU2919基因，PE]uorescens Pf-5的Dyp类型过氧化物酶家族基因以及尸 ，]uoFescens 了编码全长蛋白的基因和去掉信号肽的基因，并在EcoliBL21中进行了可溶性表 达、探索了目的蛋白最适诱导表达条件。通过Ni2+亲和层析的方法得到了纯化的全 长以及去掉信号肽的重组蛋白。生测结果表明全长以及去掉信号肽的重组蛋白都对 黑松的悬浮细胞显示了毒性。HPLC分析显示，加入全长重组蛋白和过氧化氢的黑松 松枝提取物组分发生了明显的变化，这说明此种毒素蛋白可能是一种过氧化物酶。 关键词：松萎蔫病；荧光假单胞菌GcM5-1A；木质素过氧化物酶；过氧 化物酶；基因克隆 Abstract listed of Pinewilt asoneoftheseriousdiseasesto disease(PWD)is manyspecies caused wood Pf以淞．whichis nematodesanddiffused Monochamus bypine mostlyby this and alternatus．Themechanismof diseaseisstillunknownsincethe happening ofthisdiseaseArerelatedto wood development pines，pine and in environmentalconditions．Inthis alternatu$，microorganisms paper,proteins cultureofPseudomonasGe