棘胸蛙MGC IB基因的克隆、多态性及其与嗜水单胞菌杂的抗病相关性研究.pdfVIP

lllUlllllllllllllllllllllllllllllllt llII Y2194736 棘胸蛙MHC皿基因的克隆、多态性及其与嗜水气单胞茵 感染的抗病相关性研究 摘要 棘胸蛙(PaaspinosaDavid)，又名石蛙，是我国棘蛙属中分布最广的物种之 一，目前主要分布于云南、贵州、安徽、江苏、浙江、江西、湖北、湖南、福建、 广东、广西和香港等地。与其它两栖动物一样，由于栖息地破坏、野生资源过度 利用以及全球气温变暖等造成的病菌蔓延，棘胸蛙的种群数量已经下降了30％ 左右。主要组织相容性复合体(MHC)是广泛存在于脊椎动物体内与免疫功能 密切相关的高度多态基因群，MHCII类抗原与许多动物疾病的抗病性、感病性 密切相关。MHC作为一种内在因子，其变异模式被认为在两栖动物数量的下降 中起了关键作用。棘蛙属是蛙科系统关系研究的重要类群，对研究两栖动物的系 统发育和进化有重要的意义。同时，棘胸蛙是一种具有较高经济价值的物种，研 究与其免疫力有关的MHC基因具有理论和实践的双重意义。 MHC IJB等位基因多态性与 lib类基因进行克隆与多态性分析，并研究了MHC 棘胸蛙抗病力之间的关系，为筛选MHC皿抗病相关基因分子标记，建立基因 分子标记辅助遗传育种工作提供基础。主要结果如下： IIB基 (1)利用同源扩增和RACE．PCR技术获得了棘胸蛙1136bp的MHC 因全长cDNA序列，并对其序列特征和结构进行了分析，包括765bp的开放阅 (3’帆)。通过与NCBI上已经发表的同源物种进行序列对比，确定测的基因 序列是棘胸蛙MHCIIB基因序列，其与非洲爪蟾的相似性达到72％。利用MEGA IIB基因的 4．O软件对棘胸蛙MHCIIB基因序列与其它已知的脊椎动物的MHC 序列进行比较和进化树分析。 (2)设计位于MHCHB基因两端的特异性引物，用高保真酶从五只野生棘 胸蛙中扩增该基因的开放阅读框(OI强)，挑取阳性克隆进行双向测序，结果得 到11条非重复序列；每个个体最多有三种基因型，最少有一种基因型，说明棘 l 胸蛙可能有两个DAB基因座位。得到的11条氨基酸序列分别命名为 变异其中43(17．62％)个位点出现在第--≠t-显子。 (3)为了研究MHC IIB等位基因与棘胸蛙抗病感染的相关性，用200只棘 胸蛙进行嗜水气单胞菌感染实验，利用1对特异引物，分别对40只抗病棘胸蛙 个阳性克隆的测序结果中，挑选得到26种不同的核苷酸序列，分别编码26种不 ％)氨基酸位点发现变异。分析26条序列，有45个位置发生核苷酸替换。挑选 出9个高频等位基因研究MHC皿类基因多态性与抗病性／易感性之间的关联， 经卡方检验计算9种基因型在两个群体中的出现频率，其中大部分基因型在两个 中出现的概率明显高于在死亡个体中出现的概率，它们可能与嗜水气单胞菌感染 的抵抗性相关；尽管结果不明显，但等位基因Pasa-DAB*2801更多出现在感病 个体中，说明其可能与嗜水气单胞菌感染的感病性相关。对核苷酸替换类型和位 点进行分析，结果发生在抗原结合位点的非同义碱基替换(dN)与同义碱基替 换率(dS)的比值远远大于非抗原结合位点的dN／dS，说明核苷酸替换主要发生 在exon2的抗原结合位点(Protein bindingregion，PBR)上，且抗原结合位点受 正向选择影响。 棘胸蛙；MHC 关键词： liB；eDNA；克隆；嗜水气单胞菌；多态性；抗病 M