ACE基因多态性.docVIP

实验4 颊粘膜上皮细胞基因组DNA抽提及ACE基因多态性检测 [实验目的] 掌握从微量来源的组织细胞中抽提基因组DNA，掌握PCR技术原理，了解基因多态性分析的方法。 [实验原理] 用碱裂解法抽提基因组DNA。以DNA为模板，用血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme, ACE）基因特异的引物进行PCR扩增，根据PCR扩增片段的大小进行多态性分析。ACE基因第16内含子存在一种长度为287bp片段的插入/缺失（I/D）多态性，人类存在II、ID、DD三种基因型，其频率在人种间有差异。I/D多态性与循环ACE水平有明确的关系，DD型ACE水平最高，ID次之，II最低。ACE基因I/D多态性与左室肥大（left ventricular hypertrophy, LVH）的关系是：LVH者DD型频率明显增高。本实验引物序列位于287bp片段的两侧，扩增片段包括插入/缺失的片段，故II型扩增片段长度为490bp，DD型扩增片段长度为190bp，ID型扩增片段为２个，分别为190bp和490bp。 图2. ACE基因的PCR扩增电泳图 [操作] 1. 基因组DNA抽提 (1) 10 ml溶液I漱口20秒, 收集漱口水； (2) 3000ｇ室温离心5分钟，弃上清； (3) 250 ul溶液II重悬沉淀；3000 g离心1分钟，弃上清；　 (4) 重悬沉淀于250 ul溶液Ш，振荡10秒； (5) 转移至0.5 ml离心管， 99℃加热5分钟； (6) 用50 ul溶液IV中和并振荡5秒； 3000 g离心1分钟去除细胞碎片，上清转移至0.5 ml离心管，保留上清，5 ul用于PCR. 2. PCR反应 (1) 取消毒的0.5 ml微量离心管，加入下列成分： 10×PCR Buffer 2.5μl dNTP(2.5 mM each) 2μl DNA模板 5μl 引物混合物(10μM each) 2μl ddH2O 13μl Taq DNA polymerase 0.5μl 　总体系　 25ul 　 　混匀，加石蜡油2滴。 （2）进行PCR扩增，扩增程序为：94℃变性30sec，55℃复性30sec，72℃延伸40sec，共反应35个循环。 （3）琼脂糖电泳检测：制备1％琼脂糖凝胶: 0.5克琼脂糖溶解于50ml 1XTBE电泳缓冲液，微波炉中加热2 min溶化。稍等微温后，加入溴乙锭溶液2μl作为显色剂，混合均匀并灌制琼脂糖凝胶板。取10μl PCR产物，加入2μl加样缓冲液，上样并电泳，紫外灯下观察实验结果。 注意：溴乙锭( EB)是DNA分子嵌合剂，可与DNA分子结合，在紫外光的照射下可发出橙色荧光。应当注意的是，溴乙锭具有极强的致突变能力，使用时必需谨慎。 [试剂] 溶液I: 4%蔗糖：4g蔗糖溶于水，定容于100 ml. 溶液II: 10 mM NaCl和10 mM EDTA (pH7.5): 溶液III: 50 mM NaOH 溶液IV: 1.0 M Tris-HCl (pH7.5) PCR试剂盒： ACE基因上游引物：5’-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3’ ACE基因下游引物：5’-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3’ dNTP Mix(10mM/each) Taq DNA polymeras 10×Buffer [200 mM Tris-HCl(pH8.4),500 mM KCl, 20 mM MgCl2] 电泳缓冲液1×TBE：称取Tris 54 g,硼酸 27.5 g，0.5 M EDTA 20 ml溶解，ddH2O定溶至 5 L。 1％琼脂糖-TBE，　石蜡油