感受态细胞的制备、转化与重组子的筛选 .ppt.ppt

实验原理与方法 冷CaCl2转化原理： 受体细胞处于0℃、CaCl2 低渗溶液处理后,细胞膨胀呈球形，细胞膜的通透性发生改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞( Competent cells )，外源DNA吸附于细胞表面，经42 ℃短时间热击处理，促使细胞吸附DNA复合物。 进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。 （2）互补法 蓝白斑筛选（IPTG-Xgal） 试验： 野生型大肠杆菌产生的b半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。 未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。 （2）将培养好的菌液液转入无菌的Ep管中，冰上放置10min，4℃，4000rpm, 离心10min，去上清，收集菌体。（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）； （3）用0.5ml预冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞； （4）4℃、4000r，离心10min；弃去上清液，加入50μl冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。即制成了感受态细胞悬液。 （4）取100μl转化细胞至含有抗生素的LB平板上，用灭菌的玻璃棒涂布均匀，室温放置待菌液完全被吸收后，倒置培养皿，37℃培养过夜。 *Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics * 实验三：感受态细胞的制备和转化及 重组质粒的筛选 实验目的 1、掌握大肠杆菌感受态的制备及转化的原理 2、熟悉实验的操作具体步骤，掌握无菌操作技术 3、掌握蓝白斑筛选重组质粒转化的原理 转化 将重组DNA分子导入细菌的过程外源遗传物质(如质粒DNA等)进入细菌，引起细菌遗传变化的现象。但外源DNA并不整合到宿主染色体DNA上。这是与“转导”概念不同之处 转导 借助病毒、噬菌体或其他方法将外源DNA导入细胞并整合到宿主基因组上的方法。 转染 将外援DNA直接导入真核生物细胞的过程 冷CaCl2转化过程： 转化（transformation）是质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。 （1）吸附 双链DNA吸附于受体菌表面。 （2）转入 双链DNA分子解链。一条链进入受体菌，另一条降解。 （3）自稳 外源质粒DNA分子在细胞内复制成双链。 （4）表达 体外基因随同复制子同时复制，分裂，转录翻译。 体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增值和表达。 重组子的筛选： （1）抗生素筛选法 质粒携带有选择性抗生素基因（如氨苄青霉素等），可使接受了该质粒的受体菌具有了氨苄青霉素抗性，将经过转化后的受体细胞经过适当稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化子才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素而无法存活。 乳糖操纵子的天然诱导物是乳糖 乳糖类似物异丙基-β-D -硫代半乳糖苷（IPTG） 有更强的诱导作用。 IPTG配合使用在基因工程可作蓝白斑筛选。 LacZ基因编码的乳糖苷酶 （5-溴-4氯-3-吲哚- β-D-半乳糖苷） X-gal 蓝色化合物 （LacZ基因 C端序列） 插入片段 （LacZ基因失活） LacZ基因 C端序列 LacZ酶 4．操作步骤 1）感受态细胞的制备(CaCl2法) （1）从LB平板上挑取新活化的E.coli单菌落。接种于3-5ml LB液体培养集中，37℃下振荡培养12h左右，直至对数生长后期； （2）再将该菌悬液以1：100的比例接种于LB液体培养基中，37 ℃振荡培养至OD600 达0.5左右； 2）转化 向感受态细胞中加入10 μl重组质粒DNA溶液，轻轻混匀，冰浴30min（Ep管和移液器枪头要预冷） (2) 将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中，热休克90s（不要摇动Ep管），然后将Ep管迅速转移到冰上，冷却2-5min (3) 立即向上述管中加入400μl 的LB液体培养液，然后37℃，100