养殖大菱鲆4种病菌多重pcr和荧光定量pcr检测方法的建立.pdf

养殖大菱鲆4种致病菌多重PCR和荧光定量PCR 检测方法的建立 摘 要 大菱鲆(Scophthalmus 成功后，成为我国第四次海水养殖浪潮的主要品种，是我国北方沿海地区 工厂化养殖的主导鱼类。然而，随着养殖规模的迅速扩大和集约化程度的 不断提高，各类病害接踵而至，病害问题已成为制约大菱鲆产业可持续发 展的重要瓶颈。近十年来的流行病学调查结果表明，大菱鲆疾病以细菌性 疾病为主，其中哈维氏弧菌、鳗弧菌、灿烂弧菌、迟缓爱德华氏菌是常见 致病菌，具有较强的致病性。为有效遏制疾病的发生、减少经济损失，迫切 需要建立大菱鲆重要致病菌的快速、准确、实用的检测方法。因此，本研 究以这4种致病菌为研究对象，建立多重PCR检测技术和荧光定量PCR检 测技术，以期为疾病的快速诊断及防治提供技术支撑。 1、哈维氏弧菌、鳗弧菌、灿烂弧菌、迟缓爱德华氏菌的多重PCR检测技术 的建立：在GenBank数据库中下载哈维氏弧菌的vhhP2基因序列，设计其特异 性引物；下载鳗弧菌的金属蛋白酶基因序列，设计其特异性引物；通过克隆gyrB 基因的部分序列和序列比对分析，分别设计了灿烂弧菌和鳗弧菌的gyrB基因特 异性引物。实验证明四对引物的特异性和通用性良好，对非目的菌种无交叉反应， 对目的菌种的不同来源的菌株有扩增。哈维氏弧菌、鳗弧茵、灿烂弧菌、迟缓爱 泳后，能明显区分，无非特异性扩增来干扰实验，所以本实验能在一次PCR反 CFU／ 应中同时检测出这4种致病菌。多重PCR最低能检测到哈维氏弧菌3．9x104 CFU／反应，基因组DNA201．5 反应，基因组DNA354．9 Pg， Pg，鳗弧菌6．8x104 灿烂弧菌5．8x104CFU／反应，基因组DNA204．7 CFU／ Pg，迟缓爱德华氏菌3．2×105 反应，基因组DNA967 ‘ Pg。 2、哈维氏弧菌荧光定量PCR检测技术：根据诎脚基因设计哈维氏弧菌的 荧光定量PCR引物，扩增的目片段与pMDl8．T载体连接，构建的重组质粒用来 作为标准品。选取部分稀释度的标准品来检验标准曲线的重复性。实验结果显示， 3个重复的ct值基本一致，组内重复性良好；不同时问构建的标准曲线，经方 差分析知，多数标准品的P值大于O．05，说明组间重复性良好，标准品稳定， 可以提供稳定检测结果。根据标准品拷贝数的对数值(10x)与Ct值(y)的关 低能检测到7个拷贝。 3、灿烂弧菌荧光定量PCR检测技术：测序获得灿烂弧菌的gyrB基因序列， 以此为靶基因设计特异性引物，构建质粒作为标准品。扩增后所得的标准曲线为 性良好。灿烂弧菌荧光定量PCR技术最低能检测到20个拷贝。 4、迟缓爱德华氏菌的荧光定量PCR检测技术：测序获得迟缓爱德华氏菌的 gyrB基因序列，以此为靶基因设计特异性引物，构建标准品。获得较为理想的 复性和组间重复性良好。迟缓爱德华氏菌的荧光定量PCR技术最低能检测到60 个拷贝。 5、致病菌快速检测技术的应用：采集大菱鲆病样，利用建立的多重PCR技 术和荧光定量PCR技术对其致病菌进行检测，两种快速检测方法对致病菌的鉴 rDNA进行鉴定， 定结果为迟缓爱德华氏菌。同时利用传统分子鉴定方法一16S 进一步验证了此检测结果的正确性。 本研究建立了上述4种大菱鲆重要致病菌的多重PCR和实时定量PCR检测 技术。多重PCR可在一次PCR反应中完成4种病菌的定性检测，而荧光定量PCR 可对相应致病菌进行定量检测，定性与定量相结合，又相互验证，对大菱鲆这4 种常见致病菌检测能达到准确快速定量的目的，这将为大菱鲆疾病的防控和健康 养殖提供了强有