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乙酰肝紊酶在原核细胞中的表达、纯化及其抗体在临床检测中的应用 乙酰肝素酶在原核细胞中的表达、纯化及其抗体在临 床检测中的应用 一 摘要 肝素酶(HPA)是肿瘤转移过程中的关键酶，它通过特异性识别和降解乙 酰肝素蛋白多糖(HSPG)上的硫酸肝素(HS)侧链，从而破坏细胞外基质(ECM) 和血管基底膜(BM)结构的完整性，并促使结合于硫酸肝素侧链上的生长因子、 趋化因子、酶类分子等生物活性分子释放，在肿瘤生长转移、肿瘤新血管形成等 过程中扮演重要角色。80年代中期首次发现HPA与肿瘤转移具有密切联系，但是 由于HPA含量低，性质不稳定，纯化困难，无法对HPA性质及其在临床诊断中的 应用进行深入研究。90年代末期HPA基因被成功克隆，使得关于HPA的研究进入 了快速发展期。大量研究证实，几乎所有恶性肿瘤(包括白血病)发生时HPA表 达水平和活性都会升高，特别是在肿瘤发生转移时HPA异常高表达，HPA与肿瘤 的性质及预后密切相关。因此HPA的检测在肿瘤早期诊断、转移风险评估及疗效 监测中有重要意义。． 基因重组技术使得HPA的表达得以实现，但由于HPA纯化难度大，所以到 目前为止，除几个研究小组有粗纯化的活性HPA外，尚无商品化活性HPA。HPA 的抗体是研究HPA性质及临床应用的前题。目前，商品化的HPA抗体多为以多肽 为免疫原制备而成，只有MyBioSource公司有以全长HPA为免疫原的单克隆抗体， 而到目前为止，尚无国产商品化HPA抗体。 HPA在肿瘤组织中的高表达已被多家实验室证实，HPA含量检测主要是采 等检测方法相比，血清肝素酶ELISA检测法具有很多优点，例如取材方便，容 易操作；定量准确，干扰因素少；方法简单，利于推广；采用双抗夹心ELISA方 法，既可手工操作，也可通过自动化仪器完成。与常规肿瘤标志物同时检测更有 利于肿瘤的筛查及临床辅助诊断。但目前，有关血液、体液中HPA水平定量检测 4 乙酰肝素酶在原核细胞中的表达、纯化及其抗体在临床检测中的应用 的报道较少，国内尚无相关报道。HPA抗体费用高、使用量大可能是影响这类研 究的主要原因之一，目前至少是影响本课题组开展这项研究的最重要原因。 本研究旨在利用基因重组技术获得HPA、并以其作为免疫原制备HPA抗体； 同时进行血液中HPA水平与肿瘤性质关系的研究，以进一步明确血液HPA水平作 为临床肿瘤诊断辅助指标的可能性。 利用本实验室保存的包含HPA全长序列质粒为模板，扩增除信号肽序列以 ． 外的肝素酶cDNA片段，将其插入表达载体pET一28a(+)，转化到大肠杆菌 BL21(plysS，DE3)中，并对起始诱导菌密度、诱导温度、诱导时间、诱导剂浓 wcrude亲和层析 度进行了优化，实现了重组人HPA的可溶性表达；采用HisTrap 柱对目的蛋白进行了初步纯化，Western印迹实验证实表达产物具有HPA免疫学特 性的蛋白表达产物。 以原核表达的重组HPA为免疫原，对6～8周龄的雌性Balb／c小鼠进行皮下 免疫，每隔3周皮下加强免疫，每只单次使用HPA量为30pg／只。4次免疫后， 血清抗体效价达1×105。挑选效价高的小鼠，提取脾细胞与SP2／O骨髓瘤细胞融 合制备杂交瘤细胞。一周后ELISA法筛选阳性克隆，再以有限稀释法进行亚克隆 化，最终获得了4株阳性克隆细胞株，为下一步制备鼠抗人HPA单克隆抗体提供 准备。 在尚无自制抗体的情况下，我们选择了Abnova公司的鼠抗HPA单克隆抗体 体，PPl320多抗作为ELISA夹心法的另一抗体，进行血液HPA水平在健康人群和 恶性肿瘤患者之间的比较。实验中对25例肺癌、42例消化道肿瘤患者及健康献血 者血清HPA水平进行了检测，每个样本设置3个重复孔，健康献血者血清和患者 血清在同一96孔板中检测。实验数据稳定，具可重复性：同时检测结果显示，肿 瘤患者血清HPA水平明显高于正