利用菊粉产山梨醇酵母融合菌株的构建及山梨醇发酵分析.pdf

利用菊粉产山梨醇酵母融合菌株的构建及 其山梨醇发酵的研究 摘 要 山梨醇是一种用途广泛的精细化工产品。目前山梨醇豹生产采用葡萄耱催 化还原法，微生物发酵法生产山梨醇与前者比较，具有反应条件温和、成本低 等特点，有着良好的应用前景。本文介绍高产菊粉酶的克鲁维酵母(Kluyveromyces cerevisiae)E-15菌株，通 sp．)Y．85菌株与产山梨醇的酿酒酵母(Saccharomyces 过原生质体融合构建利用菊粉产山梨醇的酵母融合菌株及其山梨醇发酵的研究 工作。 。以果糖发酵培养基，对研究室保存的酵母菌株进行山梨醇发酵筛选，得到 可产山梨醇的酿酒酵母E．15菌株。研究发现，在以高果糖浆为碳源(总糖含量 达10％)的液体发酵培养基中，其山梨醇产量可达2．98∥100ml。 利用产孢培养基培养克鲁维酵母Y_85和酿酒酵母E．15，通过分离孢子及 DNA含量测定，实验得到两菌株的单倍体菌株。通过性状考察发现：Y．85菌 株在450湿度下可在酵母完全培养基(YEPD)上生长，在基本培养基(／VIM) E不能生长；而E-15菌株不能在45。C下生艮，但在30C下，可在基本培养基 上生长。 研究探讨了E-15菌株和Y堪5菌株进行原生质体融合的条件。结果认为， h，以0．I％EDTA一巯基乙醇 在Y-85菌株菌龄小于12h，E一15菌株菌龄小于10 作脱壁预处理剂，蜗牛酶浓度为2％(wlv)，酶解温度为30C，E一15菌株细胞酶 以j!!二，再生率达25％以上。通过主要影响因子的正交试验，确定融合的适宜条 件为： CaCI，，融合时间为30min，这时两亲株原 30％(w／v)PEG和lOmmol／L 生质体融合率达10_6以上。 根据性状考察的结果，本文设计了融合子的检出方法：培养温度为45℃， 融合后的原生质体在M／vl平板上长出的菌落作为融合子。检出的227个融合子 经菊糖选择培养基及菊粉发酵培养基初步筛选，并对其中4株山梨醇产量较高 的融合菌株作了融合子的鉴定。经过DNA含量，细胞形态与火小，菌落形态 及菊粉酶活性等与两亲株进行测定比较，确认为两亲株的属间融合子。 本文进一步对F27融合菌株(山梨醇产量最高)进行山梨醇发酵的研究。 实验通过对碳源、氮源及金属离子等对山梨醇合成影响的探讨，研究得出1727 融合菌株的适宜发酵培养基配方为：菊糖(以菊粉抽提液含总糖计)10％，添 加葡萄糖lO％，酵母膏2 5％，MnSO。0．1％。 研究还探讨了发酵条件对1727融合菌株山梨醇合成的影响。通过对温度、 发酵时间、起始pH、接种量、装液量等发酵条件的探讨，认为适宜的发酵条件 为：发酵温度35。C、发酵时间72 h，接种量10％，起始pH为自然。卜述适宜 的发酵培养基和发酵条件中，F27融合菌株的山梨醇产量可达4 879／100ml。 F27融合菌株经遗传稳定性考察，连续15次传代后，山梨醇发酵性能保持 稳定。； 关键词：山梨醇发酵菊粉酵母融合株 IT onConstructionof andSorbit01—— Study Inulinl。Utilizing Fusants in FusionYeast ProducingbyIntcrgcncricProtoplast and