PCR基本原理及注意事项.pptVIP

* * PCR基本原理及注意事项 报告人：刘 凯 2011年1月14日 目录 基本原理 常见问题 反应体系 基本原理： 变性 延伸 退火 模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链 反应体系 10×扩增缓冲液 4种dNTP混合物 引物 　 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2 加双或三蒸水至 10ul200umol/L 各10～100pmol　 0.1～2ug 2.5u　 1.5mmol/L100ul 引物 酶 dNTP 模板 Mg2 五要素 PCR反应 有或能加上合适的酶切位点 与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性 引物3’端的碱基严格配对 特别是最末及倒数第二个碱基 G C含量以40-60%为宜 ATGC随机分布 避免引物内部出现二级结构 避免两条引物间互补 扩增跨度 以200-500bp为宜 15-30bp 引物 设计 酶及其浓度 栖热水生杆菌 天然酶 大肠菌合成基因工程酶 催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时) dNTP呈颗粒状，-20°C保存 1M NaOH或 1M Tris.HCL 将PH调节 到7.0～7.5 dNTP质量 与浓度 反应中，dNTP 应为50～200umol/L 小量分装 -20℃冰冻 保存 模板 核酸 DNA 纯化 RNA 纯化 蛋白酶K SDS 溶解细胞膜 解离核蛋白 与蛋白结合成沉淀 水解消化蛋白质 （组蛋白） 异硫氰酸胍或 蛋白酶K法 Mg2浓度 dNTP浓度为200umol/L时， Mg2 浓度为1.5～2.0mmol/L为宜 浓度过低会降低Taq DNA聚 合酶的活性，使反应产物减少 浓度过高，反应特异性降低， 出现非特异扩增 常见问题 假阳性 出现片状拖带或涂抹带 出现非特异性扩增带 选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性 假阳性 引物设计不合适 靶序列或扩增产物的交叉污染 空气中的小片段核酸污染 整个基因组或大片段的交叉污染 靶序列太短或引物太短 污染解决方法 操作时应小心轻柔 紫外照射 耗材一次性使用 高压消毒 巢式PCR Mg2+离子浓度过高 退火温度过低 PCR循环次数过多 引物与靶序列不完全互补、 或引 物聚合形成二聚体 酶的质和量 出现非特异性扩增带 解决方法 减低酶量或调换 另一来源的酶 适当提高退火温度或用二温度点法 重新设计引物 降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数 dNTP浓度过高 出现片状拖带或涂抹带 Mg2+浓度过高 退火温度过低 酶量过多或酶的质量差 循环次数过多