杂合抗菌肽基因MA-E的改建及其用一步蛋白纯化克隆系统表达.pdfVIP

摘要 蛙皮素一蜂毒素杂合肽是一种具有抗菌活性的碱性多肽物质，属 于人工构建基因经诱导表达的一种抗菌小肽。实验表明，杂合肽虽然 具有抗菌活性，但由于其分子量较小(约2．9KDa)，加上其在大肠杆 菌内经诱导表达后，可能对宿主菌有杀伤作用，故多肽的表达量较 少，分离、纯化也存在一定困难。本文主要针对以上问题，通过利用 聚合酶链式反应方法对杂合肽基因进行修改：一方面引入突变，在分 子水平上优化杂合肽基因，另一方面将优化基因与一步蛋白纯化系统 中含内蛋白子基因的表达载体连接，使其形成融合蛋白，以利其分 离、纯化a 根据优化杂合肽基因序列设计上、下游引物。上游引物含有突变 位点及hdeI酶的识别序列，下游引物删除终止密码后，加上甲硫氨 酸的基因密码及EcoR I酶的识别序列。优化杂合基因序列以原来基 因作模板经用聚合酶链反应方法扩增，NdeI及EcoRI酶切，乙醇 沉淀法回收后，克隆到pTYB2表达载体上，并转化到受体菌ER2566 中，经对重组质粒进行DNA序列测定，证实克隆的基因序列与设计序 列一致a表达质粒经IPTG诱导在宿主菌中表达，表达产物经 IMPACT—T7蛋白纯化系统纯化后，在TriCine—SDS一聚丙烯醮胺凝