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第17章 核酸技术Technology of Nucleic Acids 对遗传分子核酸的结构与功能的阐明，用于研究核酸的工具酶的开发，由核酸的分子杂交性质建立起的一系列分析技术，使我们已经能够按照自己的意愿来摆布和操作基因，去改变生命有机体的遗传性状，甚至制造出新的物种，以服务于人类。重组DNA技术使人类千百年的梦想变为了现实。 50年来，核酸酶学的进步为DNA的分析与鉴定提供了有力的工具。主要的核酸工具酶有： DNA聚合酶（DNA polymerase ） klenow 片段， Taq 酶 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ） 逆转录酶（Reverse transcriptase） 连接酶（Ligase） 拓扑异构酶（Topoisomerase）等 限制性核酸内切酶 —— 一把神奇的“手术刀” 具有内切和甲基化两种功能 能够识别外源的DNA并将它切开 有特异的识别位点，通常为4-8对碱基的旋转对称结构 在其切口处留下黏性末端（sticky end）——具有互补序列 的单股链（或平头末端，blunt end） 有3种类型，以II型为主 例如： EcoRI 利用一个标记的（如用同位素标记），特异的，单股DNA或RNA片段—— 探针（probe） 可以： 研究DNA之间的亲缘关系； 发现基因的缺失或突变； 测定某种遗传信息的量； 鉴定某种基因 基因治疗等 分子杂交是一系列基因鉴定方法的基础 印迹技术（ Blotting） Southern blot——用探针鉴定DNA Northern blot——用探针鉴定RNA 原位杂交（Hybridization in situ） 指纹分析（Finger printing） 基因芯片（ DNA microarray） 在人类基因组项目基本完成之后，人类蛋白质组项目将要展开，旨在对人类基因组表达的全部蛋白质进行全面的、高通量的、精细的分析，这是后基因组时代的新的研究领域，对于人类认识自己，控制疾病的意义将难以估量。 DNA核苷酸序列分析 Sanger双脱氧链终止法 从上世纪90年代初开始，用了10年时间，人类完成了 对自身染色体的30亿对碱基的序列测定，这就是所谓 的人类基因组项目（HGP） 3 核酸技术的应用 在生命科学研究中的应用 在动物疾病诊断中的应用 在动物遗传育种中的应用 在生物制药中的应用 在农业中的应用 * * 本章主要内容 DNA重组技术 基因鉴定 核酸技术的应用 一个梦想已成真 生长激素基因注入小鼠受精卵中培育出了“硕鼠” 1 DNA重组技术简介 DNA重组技术是利用多种限制性内切酶和DNA连接酶等工具酶，以DNA为操作对象，在细胞外将一种外源DNA（来自原核生物或真核生物的目的基因）和载体DNA相连接，形成重组载体，然后将重组载体转入宿主细胞（如大肠杆菌, 酵母等），使外源目的基因DNA随宿主细胞的繁殖而扩增（形成无性繁殖系，即克隆，cloning）。外源的目的基因可以在宿主细胞中得到表达获得其蛋白质产物或使生物细胞原有的遗传性状发生改变。 这种技术也称为“分子克隆”（molecular cloning）技术。基因重组技术的规模化就是“基因工程”（Genetic Engineering）。 利用重组DNA技术，胰岛素原（proinsulin）的 基因在细菌中得到表达的过程 DNA重组技术的建立要归功于核酸酶学的发展 属 种 品系 排序 限制性内切酶（有专一的切点并常在切口处留下黏性末端） 2 目的基因克隆的技术路线 1.用限制性内切酶等从基因组获得目的基因（含黏性末端） 2.选择合适的目的基因的载体，用同样的限制性内切酶切出缺口 （含黏性末端） 3.把目的基因插入到载体的缺口中去（黏性末端之间有互补关 系），并用连接酶将两者连接得到重组载体 4.将重组载体导入宿主细胞进行克隆（通过无性繁殖，目的基因随 着宿主的繁殖也扩增） 5.利用分子杂交技术，免疫化学技术对重组的克隆进行筛选 6.使重组